生信部分

一 、 數據獲取與預處理

數據下載：從TCGA數據庫下載 特定癌腫 的轉錄組數據（RNA-seq）和臨床數據。

數據清洗：去除低質量樣本和批次效應。標準化處理（如TPM、FPKM）。處理缺失值和異常值。

二 、 樣本分組

基于臨床特征分組：分期（如I、II、III、IV期）。組織類型（如腺癌、鱗癌）。生存狀態（生存組 vs. 死亡組）。

基于分子特征分組：基因表達聚類分析（如K-means、層次聚類）。分子亞型（如TCGA分子分型）。

三 、 差異分析

差異基因（DEGs）識別： 先將EnsembleID轉換成genesymbol，再 用 DESeq2 進行差異分析。一般設置顯著性閾值（如p-value < 0.05，|log2FC| > 1）。

可視化：火山圖展示差異表達基因。

四 、 功能富集分析

GO和KEGG通路分析：使用DAVID、clusterProfiler等工具進行功能注釋和通路分析。

GSEA（基因集富集分析）：分析基因集在表型間的富集情況。

五 、 生存分析

Kaplan-Meier生存分析：分析差異表達基因與患者生存時間的關系。

Cox比例風險模型：多因素Cox回歸分析，識別獨立預后因素。

六 、 構建預后模型

特征選擇：使用LASSO回歸篩選關鍵基因。

預后模型構建：基于關鍵基因構建預后風險評分模型。

模型驗證：使用訓練集和驗證集進行模型驗證，評估模型的預測性能（如ROC曲線）。

七 、 免疫浸潤分析

免疫細胞浸潤估計：使用CIBERSORT、TIMER等評估腫瘤微環境中的免疫細胞組成。

免疫相關基因分析：分析免疫相關基因的表達與患者預后的關系。

免疫檢查點分析：研究PD-1、CTLA-4等免疫檢查點基因的表達。

八 、 藥敏分析

藥物敏感性預測：使用GDSC、CTRP等數據庫預測潛在敏感藥物。

藥物靶點分析：識別差異表達基因中的潛在藥物靶點。

藥物-基因網絡構建：構建藥物與基因的相互作用網絡。

九 、 多組學整合分析

基因組學：分析關鍵基因的突變、拷貝數變異（CNV）及其與 特定癌腫 發生的關系。

轉錄組學：研究關鍵基因對全基因組表達譜的影響。

表觀 組學：分析關鍵基因的DNA甲基化、組蛋白修飾狀態。

蛋白組學：通過質譜分析研究關鍵基因對蛋白質表達和修飾的影響。

十 、 網絡分析

基因共表達網絡：使用WGCNA構建基因共表達網絡，識別關鍵模塊。

蛋白-蛋白相互作用網絡（PPI）：使用STRING數據庫構建PPI網絡，識別樞紐基因。

實驗部分

篩選出關鍵基因后， 濕 實驗可從多個角度深入驗證這些基因的功能、機制及其臨床意義。

一、 功能驗證實驗

功能驗證實驗旨在確認關鍵基因在 特定癌腫 發生、發展中的具體作用。

體外實驗（In Vitro）

① 基因表達調控

過表達：構建過表達載體，轉染 特定癌腫 細胞系，觀察基因過表達對細胞表型的影響。

敲低/敲除：使用siRNA、shRNA或CRISPR-Cas9技術敲低或敲除關鍵基因，觀察表型。

② 細胞表型分析 （ 腫瘤細胞 ）

增殖實驗：通過CCK-8、MTT或EdU實驗檢測細胞增殖能力。

遷移和侵襲實驗：通過Transwell或劃痕實驗檢測細胞遷移和侵襲能力。

凋亡實驗：通過Annexin V/PI染色或Caspase活性檢測細胞凋亡。

細胞周期實驗：通過流式細胞術分析細胞周期分布。

③ 分子機制研究

信號通路分析：通過Western Blot、qPCR等技術檢測關鍵基因對下游信號通路（如PI3K/AKT、MAPK、Wnt/β-catenin等）的影響。

互作蛋白篩選：通過Co-IP（免疫共沉淀）或質譜分析篩選與關鍵基因相互作用的蛋白。

體內實驗（In Vivo） ≈ 動物模型

① 異種移植瘤模型 ：將過表達或敲低關鍵基因的 特定癌腫 細胞接種到裸鼠或免疫缺陷小鼠中，觀察腫瘤生長、轉移和血管生成情況。

② 基因編輯小鼠模型 ：構建條件性敲除或過表達關鍵基因的小鼠模型，研究其在 特定癌腫 發生中的作用。

臨床樣本（Ex Vivo）

組織學分析 （ 病理分析 ）

通過免疫組化（IHC）檢測腫瘤組織中關鍵基因的表達及其與臨床特征的關系。

二、深度機制研究

深入研究關鍵基因在 特定癌腫 中的分子機制，揭示其調控網絡。

① 轉錄調控 ：通過ChIP-seq或ChIP-qPCR分析關鍵基因的轉錄因子結合位點。研究關鍵基因是否受表觀遺傳調控（如DNA甲基化、組蛋白修飾）。

② 非編碼RNA調控 ：研究關鍵基因 的啟動子區 是否受miRNA、lncRNA或circRNA調控。通過雙熒光素酶報告基因實驗驗證非編碼RNA與關鍵基因的相互作用。

③ 代謝調控 ：研究關鍵基因是否影響 特定癌腫 細胞的代謝（如糖代謝、氨基酸代謝）。

④ 免疫調控 ：研究關鍵基因是否影響腫瘤微環境中的免疫細胞浸潤。