撰文|易

基因編輯技術(shù)的快速發(fā)展為遺傳疾病的治療帶來了革命性突破， CRISPR-Cas9 核酸酶、堿基編輯器和先導(dǎo)編輯器等技術(shù)已能夠精確修改基因組中的短片段 DNA 序列，并在臨床治療中展現(xiàn)出顯著效果。然而，這些技術(shù)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)大片段基因（ ≥1 kb ）的靶向插入仍面臨重大挑戰(zhàn)。許多遺傳疾病，如囊性纖維化、 Stargardt 病和血友病 B ，具有高度異質(zhì)性的突變譜，使得基于核酸酶或堿基編輯的療法難以覆蓋所有患者。傳統(tǒng)的病毒載體基因療法雖然能夠遞送功能性基因拷貝，但存在插入突變風(fēng)險(xiǎn)、免疫原性以及表達(dá)調(diào)控不精準(zhǔn)等問題。因此，開發(fā)一種無需 DNA 雙鏈斷裂（ DSB ）、高效且精準(zhǔn)的大片段基因插入技術(shù)，對(duì)于實(shí)現(xiàn) “ 突變無關(guān) ” 的基因治療至關(guān)重要。

近日， 哈佛大學(xué) David R Liu 和哥倫比亞大學(xué)Samuel H Sternberg聯(lián)合在 Science 期刊上發(fā)表題為

Programmable gene insertion in human cells with a laboratory-evolved CRISPR-associated transposase

CRISPR相關(guān)轉(zhuǎn)座酶（CASTs）是一類源自細(xì)菌的 RNA 引導(dǎo)轉(zhuǎn)座系統(tǒng)，能夠通過 Tn7 樣轉(zhuǎn)座酶實(shí)現(xiàn)大片段 DNA 的靶向整合。盡管 I-F 型 CASTs 在細(xì)菌中表現(xiàn)出高效性和高特異性，但在人類細(xì)胞中的活性極低，這可能是由于轉(zhuǎn)座酶催化效率不足或與哺乳動(dòng)物細(xì)胞環(huán)境的兼容性較差。 作者 采用噬菌體輔助連續(xù)進(jìn)化（ PACE ）技術(shù)對(duì) PseCAST 的轉(zhuǎn) 座酶模塊（ TnsABC ）進(jìn)行定向進(jìn)化。 PACE 通過將轉(zhuǎn)座活性與噬菌體 M13 的復(fù)制必需基因 gIII 的表達(dá)偶聯(lián)，在連續(xù)傳代中篩選高活性突變體。具體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)包括構(gòu)建進(jìn)化回路，將 TnsABC 編碼于噬菌體基因組，并在宿主大腸桿菌中引入輔助質(zhì)粒（ CP1 和 CP2 ），通過轉(zhuǎn)座事件激活 gIII 表達(dá)。通過多輪進(jìn)化（ PACE 和 PANCE 交替進(jìn)行）逐步提高轉(zhuǎn)座效率，并優(yōu)化回路設(shè)計(jì)以避免 “ 作弊 ” 突變 ， 聚焦于 TnsB （催化核心）的進(jìn)化，結(jié)合 AlphaFold3 結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析關(guān)鍵突變對(duì)催化效率的影響。最終，將進(jìn)化后的 TnsB （ P4-15 ）與工程化 DNA 靶向模塊（ QCascade ）結(jié)合，構(gòu)建出優(yōu)化的 evoCAST 系統(tǒng)。

研究結(jié)果表明 evoCAST 系統(tǒng)在人類細(xì)胞中展現(xiàn)出卓越的基因整合能力，其性能在多方面超越了現(xiàn)有的基因編輯工具。在 HEK293T 細(xì)胞中， evoCAST 實(shí)現(xiàn)了 10-30% 的整合效率，平均達(dá)到 14% ，這一數(shù)值較野生型 PseCAST 提高了超過 200 倍。值得注意的是，這種高效率并非局限于特定細(xì)胞系或特定基因組位點(diǎn)，而是在 14 個(gè)不同測(cè)試位點(diǎn)（包括 AAVS1 安全港位點(diǎn)、 TRAC 免疫治療位點(diǎn)以及多個(gè)疾病相關(guān)基因位點(diǎn)）都表現(xiàn)出穩(wěn)定的高整合效率。這種廣譜高效性使其在治療應(yīng)用上具有顯著優(yōu)勢(shì)。

高通量測(cè)序分析顯示， evoCAST 介導(dǎo)的整合事件具有極高的位點(diǎn)特異性。與傳統(tǒng)的 CRISPR-Cas9 系統(tǒng)不同， evoCAST 在整合過程中不會(huì)產(chǎn)生可檢測(cè)的插入缺失突變，這一特性對(duì)于臨床應(yīng)用至關(guān)重要，因?yàn)樗蟠蠼档土艘蚓庉嬪e(cuò)誤導(dǎo)致的安全風(fēng)險(xiǎn)。此外， evoCAST 的整合具有明確的方向偏好性，在測(cè)試的四個(gè)基因組位點(diǎn)中，約 90% 的整合事件都保持一致的插入方向。通過改進(jìn)的 UDiTaS 全基因組分析方法， 作者 發(fā)現(xiàn) evoCAST 的脫靶整合頻率低于 3% ，且所有檢測(cè)到的脫靶事件均為單次獨(dú)立事件，沒有發(fā)現(xiàn)重復(fù)出現(xiàn)的脫靶熱點(diǎn)。

evoCAST 的另一個(gè)顯著優(yōu)勢(shì)是其對(duì)不同細(xì)胞類型的廣泛適用性。除了在 HEK293T 細(xì)胞中的優(yōu)異表現(xiàn)外，在 HeLa 和 K562 細(xì)胞系中， evoCAST 分別實(shí)現(xiàn)了 4.7% 和 1.6% 的整合效率。更重要的是，在原代人類成纖維細(xì)胞中， evoCAST 達(dá)到了 19% 的高整合效率，這為其在臨床治療中的應(yīng)用提供了有力支持。

作者進(jìn)一步測(cè)試了 evoCAST 在治療應(yīng)用方面的潛力。 在肝細(xì)胞系中， evoCAST 成功將凝血因子 IX （ F9 ） cDNA 整合到 ALB 基因內(nèi)含子 1 中，效率達(dá)到 5.7% ，并檢測(cè)到功能 性蛋白表達(dá)。在 T 細(xì)胞治療領(lǐng)域， evoCAST 在 TRAC 位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)了 13% 的 CD19 CAR 整合效率。特別值得注意的是， evoCAST 在多個(gè)遺傳病相關(guān)基因位點(diǎn)（包括 FANCA 、 IL2RG 、 MECP2 和 PAH ）都實(shí)現(xiàn)了 12-15% 的治療性 cDNA 整合效率，這種 “ 突變無關(guān) ” 的治療策略可以覆蓋同一基因的不同突變類型患者。

綜上所述，本研究通過噬菌體輔助連續(xù)進(jìn)化（PACE），獲得了平均整合活性提升200倍以上的CAST變體。進(jìn)化后的CAST系統(tǒng)（evoCAST）在人類細(xì)胞中14個(gè)測(cè)試基因組位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)了約10%至30%的千堿基級(jí)DNA片段整合效率，且未檢測(cè)到插入缺失突變（indels），脫靶整合水平較低。evoCAST的成功開發(fā)標(biāo)志著基因編輯技術(shù)在大片段DNA精準(zhǔn)整合方面取得了重大進(jìn)展，為治療多種遺傳疾病開辟了新的可能性。

https://doi.org/10.1126/science.adt5199

制版人： 十一

學(xué)術(shù)合作組織

（*排名不分先后）

戰(zhàn)略合作伙伴

（*排名不分先后）

（*排名不分先后）

轉(zhuǎn)載須知

【原創(chuàng)文章】BioArt原創(chuàng)文章，歡迎個(gè)人轉(zhuǎn)發(fā)分享，未經(jīng)允許禁止轉(zhuǎn)載，所刊登的所有作品的著作權(quán)均為BioArt所擁有。BioArt保留所有法定權(quán)利，違者必究。

BioArt

Med

Plants

人才招聘

會(huì)議資訊

近期直播推薦