上海
撰文 | 易
端粒是位于染色體末端的特殊核蛋白復合體，其核心功能是保護染色體末端不被識別為DNA雙鏈斷裂（DSB），從而防止有害的DNA損傷反應激活。在哺乳動物細胞中，這一保護作用主要由shelterin復合體介導，該復合體包含TRF1、TRF2、RAP1、TIN2、TPP1和POT1六個亞基。其中，TRF2被認為通過促進端粒DNA形成t-loop結構（一種套索狀構象）來物理性隱藏染色體末端，使其不被DNA損傷修復機器識別。然而，t-loop的組裝依賴于端粒3'單鏈懸垂的存在，而DNA復制過程中前導鏈合成的端粒是平末端的，需要通過5'端切除來生成3'懸垂，這一切除過程由Apollo核酸外切酶介導，且需要DNA依賴性蛋白激酶（DNA-PK，非同源末端連接cNHEJ途徑的核心激酶）的參與。在經典非同源末端連接（cNHEJ）過程中，DNA-PK會包裹游離DNA末端，形成包括連接酶4（LIG4）在內的下游末端連接因子的招募平臺。
這一發現提出了一個關鍵矛盾：DNA-PK作為cNHEJ的核心組分，也能結合端粒并調控其末端切除，為何在參與端粒切除的同時不會激活有害的末端連接？此外，在酵母中，Rap1蛋白被證明可以直接結合端粒DNA并抑制cNHEJ，但哺乳動物RAP1不直接結合DNA，而是通過TRF2招募到端粒，其功能一直不甚明確。
近日，英國癌癥研究所Max E. Douglas和瑞典林雪平大學Francisca Lottersberger聯合在Nature期刊上發表題為Chromosome end protection by RAP1-mediated inhibition of DNA-PK的研究論文，揭示了端粒保護的一種新機制：shelterin復合體的TRF2和RAP1蛋白通過與DNA-PK形成抑制性復合物，直接阻斷其招募連接酶LIG4的能力，從而在端粒處特異性抑制非同源末端連接（cNHEJ），與Apollo核酸酶介導的3'懸垂機制共同確保染色體末端的穩定性。
作者首先構建了多種基因編輯的小鼠胚胎成纖維細胞（MEFs）模型，包括Apollo單敲除（Apollo-/-）、Rap1單敲除（Rap1-/-）以及雙敲除（Apollo-/-Rap1-/-）細胞系，通過端粒熒光原位雜交（FISH）技術定量分析不同基因型細胞中染色體融合的頻率，并利用LIG4（cNHEJ必需連接酶）敲除細胞驗證融合事件的機制依賴性，發現在Apollo-/-Rap1-/-雙敲除MEFs中，約15%的端粒發生了LIG4依賴性的染色體型融合，而單敲除細胞未出現這一表型。在人RPE-1細胞中，APOLLO-/-RAP1-/-雙敲除導致20-30%的端粒融合，且這些融合端粒均來源于前導鏈復制的染色體末端。這些結果證明哺乳動物端粒通過兩條獨立途徑抑制cNHEJ：一條是Apollo依賴的3'懸垂途徑，另一條是RAP1介導的獨立于懸垂的保護機制。這些證據直接揭示了RAP1在端粒保護中的關鍵作用。
冷凍電鏡結構顯示，RAP1通過其Myb結構域插入端粒DNA的大溝，與KU70的SAP結構域形成協同結合；同時，RAP1的BRCT結構域精確占據了KU70/KU80表面的酸性區——這正是LIG4的結合位點。這種獨特的空間排布產生了“分子剎車”效應：當RAP1與DNA-PK結合時，其BRCT結構域通過空間位阻直接阻斷LIG4的招募，從而抑制cNHEJ的完成。這一機制得到系列突變實驗的支持：破壞RAP1-KU相互作用的突變均導致LIG4重新招募和端粒融合；同樣，破壞Myb-DNA相互作用的RAP1(R133E)突變體也喪失了保護功能。
系統發育分析表明RAP1-KU相互作用在進化上高度保守，可能早于Apollo在端粒功能中的特化。這一古老的保護機制在哺乳動物中繼續發揮重要作用，特別是在端粒縮短的衰老細胞或復制壓力條件下，當t-loop結構不穩定或Apollo介導的切除受阻時，RAP1通路可提供關鍵的保護作用。研究還發現，僅需少量端粒重復序列即可支持TRF2-RAP1的抑制功能，這解釋了該機制如何保護嚴重縮短的端粒免于cNHEJ。這些發現不僅解決了“DNA-PK參與端粒代謝但抑制cNHEJ”的長期悖論，也為理解端粒相關疾病（如早衰綜合征）的發病機制提供了新視角。
綜上所述，端粒保護蛋白復合體shelterin的RAP1和TRF2組分能與DNA-PK形成復合物，直接抑制其在端粒處的末端連接功能。當RAP1與TRF2結合時，會與KU蛋白及DNA建立相互作用網絡，從而阻止DNA-PK招募LIG4。在小鼠和人類細胞中，RAP1與Apollo核酸酶在抑制染色體末端cNHEJ方面具有功能冗余性，表明DNA-PK的抑制作用與懸垂依賴性機制并行不悖地防止端粒融合。本研究證實，DNA-PK的末端連接功能在端粒處被直接且特異地抑制，這為解釋哺乳動物細胞如何維持單個線性染色體的穩定性提供了分子機制。
https://doi.org/10.1038/s41586-025-08896-1
制版人： 十一
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