? 研究背景

糖尿病足潰瘍是糖尿病的嚴重并發癥之一，治療時間較長，給患者帶來嚴重的經濟負擔，并且有癱瘓的風險。糖尿病傷口的高血糖微環境，易受到嚴重的氧化應激和細菌生長的影響，因此，減少氧化應激和抑制傷口部位的細菌生長是治療的關鍵策略。研究發現，在糖尿病傷口中，高葡萄糖（HG）環境會抑制谷胱甘肽過氧化物酶 4（GPX4）和鐵蛋白重鏈 1 （FTH1） 的活性，導致 Fe2+ 積累和活性氧（ROS）產生，而鐵死亡會加劇芬頓反應，促進氧化應激。另外，鐵作為細菌蛋白質的重要輔助因子，在細菌生長過程中，不僅控制著它們的細胞功能，并參與關鍵的代謝途徑。細菌已經進化出各種復雜的機制來獲得 Fe3+ 以維持其生長和新陳代謝。

水凝膠具有細胞外基質樣結構和優異的生物相容性，可長時間保持傷口水分，是傷口敷料的主要選擇。膠原蛋白、藻酸鹽、殼聚糖和透明質酸等是制備水凝膠的天然聚合物，其中含量最豐富的膠原蛋白在所有愈合階段的組織結構和傷口愈合中起著重要作用，目前，工業用膠原蛋白的主要自豬和牛等陸生哺乳動物，存在疾病傳播的風險，而從魚皮中提取的魚皮膠原蛋白 （Co）具有較大的生物安全性，是理想替代品，但其熱穩定性和機械性能較差，限制著其臨床應用。

原兒茶醛（PCA）是一種天然酚類化合物，具有優異的抗炎和抗菌特性，常用于治療冠心病和傷口感染。其鄰苯二酚基團賦予其清除活性氧（ROS）的能力，可有效緩解糖尿病傷口的氧化應激。研究發現，PCA可通過鄰苯二酚基團與Fe2+和Fe3+形成穩定的螯合物，降低游離 Fe2+ 和 Fe3+ 濃度，從而減少氧化應激并抑制細菌生長，同時干擾細胞鐵死亡和破壞細菌鐵穩態。原兒茶醛-鐵（III）螯合物（PCA@Fe）不僅保留了PCA的抗氧化性能，還可以增強水凝膠的機械強度和光熱性能，在糖尿病傷口治療中減少氧化應激和抑制細菌感染。

? 主要內容

基于此，山東中醫藥大學秦松團隊研究開發了一種創新的多功能鈷基水凝膠——CFP，通過鈷（Co）、原兒茶醛（PCA）與鐵離子（Fe3?）的協同作用構建而成。該水凝膠經席夫堿鍵交聯氨基（—NH?）和醛基（—CHO）形成，顯著增強了機械強度與熱穩定性，而PCA與Fe3?形成的螯合物 PCA@Fe 進一步優化了其力學性能并賦予高效光熱轉換特性。CFP不僅保留了鈷促進血管生成和膠原重塑的生物學功能，還通過螯合Fe2?有效抑制芬頓反應，減少脂質過氧化，從而緩解氧化應激及鐵下垂引起的線粒體損傷。同時，PCA對Fe3?的螯合作用破壞了細菌鐵穩態，結合光熱刺激協同增強了抗菌活性，顯著改善了糖尿病傷口的細菌感染管理，為糖尿病傷口治療提供了集抗氧化、抗菌與促修復功能于一體的新型材料解決方案。

Scheme：CFP 合成和治療機制的示意圖

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PCA@Fe 和 CFP 的表征和性質

研究制備了多功能鈷基水凝膠（CFP），通過紫外光譜、拉曼光譜、X射線光電子能譜（XPS）及傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）等方法證實了PCA@Fe螯合物的形成，其中Fe3?和Fe2?共存，且PCA可能作為還原劑參與鐵離子價態轉化。掃描電鏡（SEM）顯示CFP具有多孔結構，有利于吸收傷口滲出物，同時流變學測試表明其在25-45°C范圍內儲能模量（G?）穩定，且具備動態彈性網絡和自修復能力，1%至1000%應變循環后模量可完全恢復。溶脹實驗表明CFP20:1 在2小時內達到溶脹平衡，體外釋放和降解實驗顯示72小時累積釋放率約48.2%，降解率達64.2%，體內植入實驗進一步驗證其3天內降解83.6%，表明其具備緩釋功能、優異降解性能及生物安全性。此外，CFP展現出自愈合特性，可自發重組，并在手指關節彎曲時保持緊密粘附，凸顯其在動態傷口環境中的實際應用潛力。

Figure 1、 A） PCA@Fe 的紫外-可見光譜。B） PCA@Fe 的拉曼光譜。C） Co 和 CFP 的 FT-IR 光譜。D） CFP 20：1 在室溫下的宏觀和 SEM 圖像。比例尺為 200 μm。E） 不同比例的 CFP 的溫度掃描。F） 不同比例 CFP 的角度頻率掃描曲線。G） 不同比例的 CFP 的流變自愈特性，應變從 1% 切換到 1000%，持續 3 個周期。H） 不同比例的 CFP 的溶脹率 （ n = 3）。I） CFP 中 PCA@Fe 的累積釋放率 （ n = 3）。J） 宏觀的自我修復顯示，從原始的 CFP 到破損的 CFP，再到愈合的 CFP。K） CFP 在手指上的彎曲試驗。

生物安全性

通過多維度實驗驗證了CFP材料的生物安全性與應用潛力。在體外實驗中，250μg/mL Co、1μg/mL PCA、10μg/mL PCA@Fe及500μg/mL CFP均未對細胞產生顯著毒性，且在高糖環境下顯著提升了L929成纖維細胞和人臍靜脈內皮細胞的存活率，表現出對葡萄糖誘導毒性的保護作用。特別值得注意的是，CFP聯合近紅外光熱處理未降低細胞存活率，證實其光熱安全性。體內實驗進一步顯示，SD大鼠皮下植入CFP 14天后，主要臟器H&E染色未見病理改變，血液生化指標（包括白細胞、紅細胞、血小板等）均保持正常范圍。這些結果表明，CFP具有優異的生物相容性，可作為糖尿病傷口修復等臨床場景的安全候選材料。

PCA@Fe 和 CFP 的光熱分析

研究系統評估了CFP材料的光熱特性，以探索其在光熱治療中的潛力。實驗表明，PCA@Fe在839nm近紅外波段具有強吸收，且808nm近紅外光因其生物安全性被選為實驗光源。與PBS組相比，PCA@Fe展現出顯著的光熱效應。進一步研究發現，摻入鈷的CFP保持了優異的光熱性能，其溫度升高與近紅外光強度呈正相關。在1.0 W cm-2 功率密度下，CFP溫度穩定在67.5°C，實現了治療效果與生物安全的最佳平衡。此外，CFP在多次光熱循環中表現出高穩定性，且PCA@Fe和CFP的光熱轉換效率分別達79.97%和77.36%。紅外熱成像直觀驗證了兩者穩健的光熱特性。這些結果共同表明，CFP是一種具有可控溫度管理能力和高穩定性的潛在臨床光熱材料。

Figure 3、A） PBS 和 PCA@Fe 在 808 nm 激光照射 （1.0 W cm?2） 下 60 秒的溫度升高曲線 B） PBS 和 CFP 在 808 nm 激光照射 （1.0 W cm?2） 下 180 秒的溫度升高曲線 C） CFP 在不同功率密度下 808 nm 激光照射下 180 秒的加熱曲線 D） CFP 在 808 nm 激光下通過四個加熱循環的光熱穩定性和冷卻過程。E） 在 808 nm 激光照射下，在 1.0 W cm-2 下 90 秒以及關閉激光器后的自然冷卻過程（黑色曲線）和 -Ln（θ） 的線性時間數據（紅色曲線）。F） PCA@Fe 和 CFP 基團 180 s 的紅外熱圖像。

CFP通過抑制鐵死亡來緩解氧化應激反應

實驗表明，在高糖（HG）環境下，CFP顯著降低成纖維細胞內活性氧（ROS）水平及線粒體膜電位損傷，恢復線粒體功能。其作用機制包括：通過PCA的多酚結構螯合過量Fe2+，減少鐵離子積累；上調谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）和鐵蛋白重鏈1（FTH1）表達，抑制脂質過氧化關鍵介質丙二醛（MDA）生成，同時提升還原型谷胱甘肽（GSH）水平，形成抗氧化防御體系。值得注意的是，CFP中的Fe3+未加劇脂質過氧化反應，反而通過穩定配位限制鐵介導的氧化損傷，且鐵輸出蛋白FPN表達增強進一步減少細胞內鐵蓄積。這些協同效應有效抑制鐵死亡通路，保護細胞免受氧化應激損傷，為CFP作為糖尿病傷口治療材料提供了分子機制層面的證據，突顯其通過調控鐵代謝與氧化還原平衡促進傷口愈合的潛力。

Figure 4、 A） 使用 DCF 作為熒光探針 （ n = 3） 用 PCA、PCA@Fe、CFP 處理的 HG-L929 細胞中 DCF 的熒光圖像。比例尺為 100 μm。B） 用 PCA、PCA@Fe、CFP 處理的 HG-L929 細胞中 DCF 的相對熒光強度。數據表示為均值±標準差 （SD） （ n = 3），顯著差異（單因素方差分析 （ANOVA））：** p < 0.01，*** p < 0.001。C） 用 PCA、PCA@Fe、CFP 處理后 HG-L929 中用 JC-1 探針測量的線粒體膜電位的變化。紅色和綠色熒光分別對應于 JC-1 聚集體和單體 （ n = 3）。比例尺為 100 μm。D） 用 PCA、PCA@Fe、CFP 處理后 HG-L929 中 JC-1 的紅色熒光強度與綠色熒光強度之比的測定。數據表示為均值± SD （ n = 3），顯著差異（單因素方差分析）：** p < 0.01，*** p < 0.001。E） 使用 FerroOrange 作為熒光探針 （ n = 3） 用 PCA、PCA@Fe、CFP 處理的 HG-L929 細胞中 FerroOrange 的熒光圖像。比例尺為 50 μm。F） FerroOrange 在用 PCA、PCA@Fe、CFP 處理的 HG-L929 細胞中的相對熒光強度。數據表示為均值± SD （ n = 3），顯著差異（單因素方差分析）：** p < 0.01，*** p < 0.001。G） 用免疫熒光檢測 PCA、PCA@Fe、CFP 處理的 HG-L929 細胞中的 GPX4 （ n = 3）。比例尺為 100 μm。H） 用 PCA、PCA@Fe、CFP 處理的 HG-L929 細胞中 GPX4 的相對熒光強度。 數據表示為均值± SD （ n = 3），顯著差異（單因素方差分析）：*** p < 0.001。I） 用 PCA、PCA@Fe、CFP 處理的 HG-L929 孵育 24 小時后 GPX4、FTH1 和 FPN 的蛋白質印跡圖像 （ n = 3）。J） 用 PCA、PCA@Fe、CFP 處理的 HG-L929 細胞中 LPO 的相對熒光強度。數據表示為 SD ±平均值 （ n = 3），顯著差異（單因素方差分析）：** p < 0.01，*** p < 0.001。K） PCA、PCA@Fe、CFP 處理的 HG-L929 的 MDA 含量。數據表示為均值 ± SD （ n = 3），顯著差異（單因素方差分析）：* p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001。L） PCA、PCA@Fe、CFP 處理的 HG-L929 的 GSH 含量。數據表示為均值± SD （ n = 3），顯著差異（單因素方差分析）：* p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001。

Co和CFP對細胞增殖和血管生成的影響

CFP通過多維度生物學效應促進糖尿病傷口愈合。實驗采用高糖（HG）刺激的人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）和成纖維細胞（L929）模型，通過劃痕試驗、透孔試驗、細胞增殖分析及血管生成試管實驗等系列技術，發現鈷離子（Co2?）與CFP水凝膠均顯著增強內皮細胞遷移能力、成纖維細胞增殖活性及血管新生能力。具體表現為：CFP組細胞遷移速率提升、血管樣管腔結構形成增加，且成纖維細胞膠原蛋白合成相關功能恢復。研究揭示鈷基材料通過雙重機制發揮作用——既通過釋放鈷離子直接激活細胞活性，又借助CFP載體實現生物活性成分的緩釋與靶向作用。這些發現印證了鈷基水凝膠在糖尿病微環境中修復血管生成障礙與膠原重塑缺陷的潛力，為其作為新型傷口敷料提供了關鍵機制依據。

Figure 5、 A） 在 12 、 24 和 48 小時 （n = 3） 用 Co 和 CFP 處理的 HG-L929 中的細胞劃痕圖像。比例尺為 100 μm。B） 在 12、24 和 48 小時時不同組之間的細胞遷移水平的定量。數據表示為均值± SD （n = 3），顯著差異（單因素方差分析）：*** p < 0.001。C） 用 Co 和 CFP 處理的 HG-HUVECs 的遷移圖 （n = 3）。比例尺為 100 μm。D） 定量分析用 Co 和 CFP 處理后遷移的細胞數量。數據表示為 SD ±平均值 （n = 3），顯著差異（單因素方差分析）：*** p < 0.001。E） Co 和 CFP 處理后 HG-HUVECs 中管形成的體外圖像 （n = 3）。比例尺為 100 μm。F） 用 Co 和 CFP 處理的 HG-HUVECs 中形成的管數的定量分析。數據表示為均值± SD （n = 3），顯著差異（單因素方差分析）：** p < 0.01，*** p < 0.001。G） 用 Co 和 CFP 處理的 HG-L929 細胞的增殖 （n = 3）。比例尺為 100 μm。H） Co 和 CFP 處理的 HG-L929 增殖數的定量分析。數據表示為 SD ±平均值 （n = 3），顯著差異（單因素方差分析）：** p < 0.01，*** p < 0.001。

CFP和CFP+NIR的體外抗菌活性

受PCA獨特酚結構和CFP優異光熱性能啟發，CFP材料在近紅外光激活下對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌展現出顯著抗菌效果。實驗通過細菌菌落計數、生物膜染色及3D共聚焦顯微鏡觀察等方法證實，CFP+NIR組幾乎完全抑制細菌生長，并嚴重破壞細菌生物膜結構。進一步分析顯示，PCA與Fe3+的穩定螯合作用限制了細菌對鐵離子的吸收，而光熱效應則直接導致細菌膜損傷和細胞內容物泄漏，從而協同增強抗菌活性。這些發現為CFP作為光熱激活型抗菌材料在生物醫學領域的應用提供了有力支持。

Figure 6、 A） 金黃色 葡萄球菌和 大腸桿菌 懸浮液用不同組（PBS、PCA、PCA@Fe、CFP、CFP + NIR）處理后的板涂層實驗 （ n = 3）。B） 3D CLSM 圖像描繪了暴露于各種處理（PBS、PCA、PCA@Fe、CFP、CFP + NIR）后生物膜的活/死染色。比例尺為 50 μm。C） 用不同組（PBS、PCA、PCA@Fe、CFP、CFP + NIR）處理的 金黃色葡萄球菌 和 大腸桿菌 懸浮液的 OD600 值。數據表示為 SD ±平均值 （ n = 3），顯著差異（單因素方差分析）：*** p < 0.001。D） 檢測不同組（PBS、PCA、PCA@Fe、CFP、CFP + NIR）的金黃色葡萄球 菌 和 大腸桿菌 活力。數據表示為均值± SD （ n = 3），顯著差異（單因素方差分析）：* p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001。E） 用不同組 （PBS、PCA、PCA@Fe、CFP、CFP + NIR） 處理后的 金黃色 葡萄球菌和 大腸桿菌 蛋白泄漏 （ n = 3）。數據表示為 SD ±平均值 （ n = 3），顯著差異（單因素方差分析）：*** p < 0.001。

CFP+NIR通過抑制鐵穩態和熱刺激細菌誘導氧化應激導致細菌死亡

通過轉錄組學分析揭示了CFP+NIR協同抗菌的分子機制。實驗發現，CFP在近紅外光激活后，通過PCA對Fe3+的螯合作用顯著抑制細菌鐵離子吸收，同時光熱效應引發細胞熱損傷，二者協同導致大腸桿菌鐵穩態失衡。轉錄組數據顯示，處理組562個基因上調、570個基因下調，其中鐵硫簇代謝、鐵離子結合相關基因顯著下調，而氧化應激響應基因上調。KEGG通路分析進一步表明，硫代謝和生物膜形成通路受抑制，氧化磷酸化過程被激活。機制上，鐵穩態破壞直接削弱細菌呼吸鏈功能，導致ATP合成受阻及抗氧化防御崩潰，最終通過氧化應激加劇和能量代謝紊亂引發細菌死亡。該研究闡明了CFP作為光熱-化學協同抗菌劑的雙模態作用路徑。

Figure 7、 A） 維恩圖顯示 PBS 和 CFP + NIR 處理的大 腸桿菌 的交集靶基因。B） 火山圖說明了差異基因表達譜，灰色為無意義基因，紅色為上調基因，藍色為下調基因。C） 熱圖顯示了參與細菌代謝途徑的基因的表達水平，其中紅色表示高表達，藍色表示低表達。D） 下調基因的 GO 富集分析。E） 上調基因的 GO 富集分析。F） 下調基因的 KEGG 通路富集分析。G） 上調基因的 KEGG 通路富集分析。

CFP加速糖尿病傷口愈合

CFP復合水凝膠協同近紅外光療（CFP+NIR）對糖尿病慢性傷口愈合的多模態調控作用。通過構建Ⅰ型糖尿病大鼠模型，研究者發現CFP+NIR組在14天治療周期內呈現最優的傷口愈合率，其愈合速度顯著優于市售3M敷料組及單純CFP組。機制上，CFP通過PCA@Fe的Fe3+螯合作用與光熱效應協同實現雙重抗菌：CFP+NIR組傷口細菌菌落數較3M組減少98.7%，光熱治療使局部溫度升至50.8°C，有效破壞細菌生物膜并引發蛋白質泄漏。此外，CFP的3D多孔結構賦予其優異止血性能，在肝出血模型中失血量較商用紗布減少76.4%。轉錄組學分析進一步揭示，CFP+NIR通過抑制鐵硫簇代謝相關基因表達、干擾細菌鐵穩態，并誘導氧化應激反應實現殺菌效應。該研究證實CFP作為集光熱抗菌、促血管生成、膠原重塑及止血功能于一體的智能生物材料，在糖尿病傷口治療領域具有顯著臨床轉化潛力。

圖 8、A） 動物實驗設計示意圖。B） 描繪 1 型糖尿病大鼠在施用 3M、CFP 和 CFP + NIR 后不同時間點（1、3、7 和 14 天）全層皮膚缺損的代表性圖像 （n = 3）。比例尺為 0.5 厘米。C） 不同組 （n = 3） 14 天內傷口閉合的痕跡。D） 用 3M、CFP 和 CFP + NIR 給藥 3、7 和 14 天的 1 型糖尿病大鼠模型的傷口愈合率評估。數據表示為均值± SD （n = 3），顯著差異（單因素方差分析）：* p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001。E） 從糖尿病傷口中提取的細菌集落形成單位 （CFU） 的體外培養計數 （n = 3）。F） CFP + NIR 在 808 nm 激光照射 （1.0 W cm-2） 下 90 秒 （n = 3） 的紅外熱圖像。G） CFP + NIR 在 808 nm 激光照射 90 s 下的加熱曲線。數據表示為 SD ±平均值 （n = 3）。H） 評估對 CFP 治療肝臟的出血影響的分析。數據表示為 SD ±平均值 （n = 3），顯著差異 （學生檢驗）： *** p < 0.001。

CFP在不同階段加速了糖尿病傷口愈合的恢復

通過構建糖尿病大鼠模型，研究發現CFP在炎癥期（3天）顯著減少中性粒細胞和巨噬細胞浸潤，其抗菌效能源于PCA@Fe的Fe3+螯合作用與光熱效應協同抑制細菌增殖；在血管生成期（7天），CFP促進CD31陽性內皮細胞密度增加，鈷元素與PCA@Fe的協同作用加速血管再生；在膠原重塑期（14天），CFP顯著提升Ⅰ型膠原（Col1）表達，形成致密纖維網絡。特別地，CFP+NIR組通過光熱調控實現炎癥-血管生成-膠原重塑的級聯優化，其治療效果顯著優于市售3M敷料。H&E染色與Masson染色結果證實，CFP通過多靶點干預機制，有效克服糖尿病傷口過度炎癥、血管生成障礙及膠原代謝紊亂等病理瓶頸，為開發智能型傷口敷料提供了科學依據。

圖 9、A） 第 3 天、第 7 天和第 14 天 （n = 3） 用 3M、CFP 和 CFP + NIR 治療的 1 型糖尿病傷口的 H&E 染色圖像。比例尺為 100 μm。B） 第 7 天 （n = 3） 用 3M、CFP 和 CFP + NIR 治療的糖尿病傷口中 CD31 表達的免疫組織化學染色圖像。比例尺為 100 μm。C） 術后 14 天 （n = 3） 用 3M、CFP 和 CFP + NIR 治療的 1 型糖尿病傷口的 Masson 三色染色。比例尺為 100 μm。D） 第 14 天 （n = 3） 用 3M、CFP 和 CFP + NIR 治療的糖尿病傷口中 Col1 的免疫熒光圖像。比例尺為 100 μm。

CFP可以通過抑制傷口部位的鐵死亡來緩解氧化應激反應，并通過促進M1至M2巨噬細胞的極化來減少炎癥

實驗表明，CFP在第7天通過上調GPX4和FTH1表達，降低MDA水平并提升GSH含量，有效緩解傷口組織氧化應激及鐵死亡。其作用機制包括：PCA@Fe螯合過量Fe2+減少脂質過氧化，同時鈷元素促進抗氧化蛋白合成。此外，CFP通過調節巨噬細胞極化，在第3天顯著降低M1型巨噬細胞標志物iNOS表達，提升M2型標志物CD206水平，加速炎癥向增殖階段過渡。CFP+NIR組更通過光熱效應增強抗菌作用，減少IL-6等炎癥因子表達。這種雙重調控策略——既通過鐵代謝干預抑制氧化損傷，又通過免疫調節控制炎癥反應——使CFP成為改善糖尿病慢性傷口病理微環境、促進組織修復的創新型生物材料。

圖 10、A） 熒光顯微鏡圖像，描繪了治療后第 7 天 （n = 3） 用 3M、CFP 和 CFP + NIR 治療的 1 型糖尿病大鼠傷口部位的 DHE 染色。比例尺為 100 μm。B，C） 免疫熒光圖像顯示第 7 天 （n = 3） 用 3M、CFP 和 CFP + NIR 治療的糖尿病大鼠傷口中 GPX4 和 FTH1 的表達。比例尺為 100 μm。D） 免疫熒光圖像顯示第 3 天 （n = 3） 用 3M、CFP 和 CFP + NIR 治療后糖尿病大鼠傷口中的 INOS 和 CD206。比例尺為 100 μm。E） 第 3 天 （n = 3） 用 3M、CFP 和 CFP + NIR 治療的糖尿病傷口中 IL-6 表達的免疫熒光圖像。比例尺為 100 μm。F-H） 定量分析第 7 天用 3M、CFP 和 CFP + NIR 處理的傷口中 DHE、GPX4 和 FTH1 的相對免疫熒光強度。數據表示為均值 ± SD （n = 3），顯著差異（單因素方差分析）：* p < 0.05，*** p < 0.001。I） 第 3 天用 3M、CFP 和 CFP + NIR 治療的傷口中 INOS 與 CD206 免疫熒光強度比率的定量評估。數據表示為 SD ±平均值 （n = 3），顯著差異（單因素方差分析）：*** p < 0.001。

參考文獻

Xinrong Geng, Wenjun Li, Jinqi Qu, Qi Wang, Tuanjie Che, Libo Yan, Hongli Cui, Dongting Liu, Song Qin

Modified Fish-Skin-Collagen-Based Hydrogels with Antioxidant and Antibacterial Functions for Diabetic Wound Healing

DOI: 10.1002/adhm.202501456

Pub Date : 2025-06-16

https://doi.org/10.1002/adhm.202501456

來源：納米醫界探索