近日，復(fù)旦大學(xué)曹緯倩團(tuán)隊(duì)在《科學(xué)通報(bào)》復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院建院20周年專輯上發(fā)表題為“位點(diǎn)特異性糖基化蛋白質(zhì)組學(xué)研究回顧與展望”的綜述文章，系統(tǒng)回顧了過去二十年基于質(zhì)譜的糖蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展歷程，深入探討了糖肽富集技術(shù)、質(zhì)譜分析方法、數(shù)據(jù)解析工具及數(shù)據(jù)庫建設(shè)等方面的進(jìn)展，重點(diǎn)聚焦于完整糖肽解析的研究成果。同時(shí)，指出了當(dāng)前糖蛋白質(zhì)組學(xué)研究中亟需解決的問題，并展望了未來在解析深度、全面性、準(zhǔn)確性及生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用等方面的發(fā)展方向。

糖質(zhì)是繼核酸和蛋白質(zhì)之后的第三條生命鏈。過去二十年間，隨著質(zhì)譜技術(shù)的革新，糖蛋白質(zhì)組學(xué)研究實(shí)現(xiàn)了從位點(diǎn)鑒定到完整糖肽解析的重大跨越。這些技術(shù)進(jìn)步為癌癥、免疫疾病等重大疾病的機(jī)制研究提供了全新視角，也為相關(guān)生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)奠定了方法學(xué)基礎(chǔ)。近日，復(fù)旦大學(xué)曹緯倩課題組對位點(diǎn)特異性糖基化蛋白質(zhì)組學(xué)研究進(jìn)行了回顧與展望。

文中首先梳理了過去二十年間基于質(zhì)譜的糖蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)展歷程。2012年之前，受限于技術(shù)手段，主要采用"去糖鏈"策略進(jìn)行糖基化位點(diǎn)鑒定，雖能實(shí)現(xiàn)位點(diǎn)定位，但丟失了關(guān)鍵的糖鏈結(jié)構(gòu)信息。2012年后，完整糖肽鑒定技術(shù)體系逐步建立：通過開發(fā)多重碎裂模式獲取更完整的譜圖信息，或借助預(yù)建庫策略優(yōu)化檢索效率，提升鑒定能力。2017年以來，糖蛋白質(zhì)組學(xué)迎來快速發(fā)展期，在通量和精度方面取得突破性進(jìn)展。高效富集方法、創(chuàng)新質(zhì)譜技術(shù)和智能數(shù)據(jù)分析平臺的整合應(yīng)用，不僅大幅簡化了分析流程，更使糖肽鑒定數(shù)量與準(zhǔn)確性顯著提升。

糖蛋白質(zhì)組學(xué)研究面臨著糖肽低豐度（<5%總肽段）和高度異質(zhì)性的雙重挑戰(zhàn)，非糖肽的離子抑制效應(yīng)導(dǎo)致質(zhì)譜中目標(biāo)糖肽的信號強(qiáng)度降低，同時(shí)使糖肽檢測的信噪比顯著下降。為此，研究者們開發(fā)了多元化的富集技術(shù)體系，包括酰肼化學(xué)法、硼酸化學(xué)法、凝集素親和層析、體積排阻、親水作用色譜以及新型功能材料。

完整糖肽的質(zhì)譜解析一直面臨著獨(dú)特的技術(shù)挑戰(zhàn)。由于糖鏈具有復(fù)雜的分支結(jié)構(gòu)，且糖鏈與肽段在質(zhì)譜中的碎裂行為存在顯著差異，傳統(tǒng)蛋白質(zhì)組學(xué)的分析方法和解析工具難以實(shí)現(xiàn)完整糖肽的準(zhǔn)確鑒定。這主要體現(xiàn)在兩個(gè)方面：首先，糖鏈與肽段的碎裂能級存在差異；其次，糖苷鍵與肽鍵的斷裂模式不同。這些特性使得常規(guī)的蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法在糖肽鑒定中效果有限。

為攻克這些技術(shù)難題，近二十年來質(zhì)譜技術(shù)和解析算法協(xié)同發(fā)展，取得了系列重要突破。在質(zhì)譜技術(shù)方面，從基礎(chǔ)的單一碎裂模式（如離子阱CID、束型CID、HCD、ETD），到組合碎裂模式（如ETciD、EThcD），再到創(chuàng)新的階梯能量HCD-MS/MS方法。這些技術(shù)進(jìn)步使得糖肽鑒定的通量較2010年提升了3個(gè)數(shù)量級，工作流程也從早期的"多流程鑒定"優(yōu)化為"單次實(shí)驗(yàn)完成"的高效模式。

在算法開發(fā)方面，糖肽解析軟件目前經(jīng)歷了三個(gè)重要的發(fā)展階段。早期（2016年前）的解析工具主要依賴預(yù)建庫，如GRIP、GPQuest；隨后發(fā)展出支持多碎片類型解析的平臺，如Byonic、GlycoPAT；如今，出現(xiàn)了具有完整糖肽水平質(zhì)控、高效解析策略的解析工具，如pGlyco3、MSFragger-Glyco，以及預(yù)測技術(shù)，如DeepGP、DeepGlyco。這些算法進(jìn)步大大提高了糖肽鑒定的準(zhǔn)確性和可靠性。與此同時(shí)，糖肽定量技術(shù)也取得了突破性進(jìn)展，形成了兩大主要技術(shù)路線：基于DIA策略的定量工具，如GproDIA平臺的定量功能；以及基于DDA鑒定結(jié)果的定量工具，如pGlycoQuant的缺失值填補(bǔ)功能。這些技術(shù)進(jìn)步共同構(gòu)成了完整糖肽解析體系，為糖基化研究提供了強(qiáng)有力的方法學(xué)支撐，極大地推動(dòng)了糖蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展。

隨著糖蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)的不斷生成，海量數(shù)據(jù)的深度挖掘已成為該領(lǐng)域的研究重點(diǎn)，催生了多層次數(shù)據(jù)庫體系的構(gòu)建，如GlycoStore、Glycosciences.DB等糖鏈數(shù)據(jù)庫；UniPep等含修飾位點(diǎn)的糖鏈庫，含有位點(diǎn)特異性數(shù)據(jù)；以及GlycAP等下游分析平臺，支持定量分析、臨床分析等。這些數(shù)據(jù)庫的建立為糖蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供了重要的數(shù)據(jù)支撐和工具保障。

當(dāng)前，糖蛋白質(zhì)組學(xué)已展現(xiàn)出巨大的研究價(jià)值和應(yīng)用潛力，正逐步發(fā)展成為生命科學(xué)的核心研究領(lǐng)域之一。該領(lǐng)域的研究范式已實(shí)現(xiàn)從簡單的糖基化位點(diǎn)鑒定到完整糖肽精細(xì)解析的重大跨越。特別值得關(guān)注的是，深度學(xué)習(xí)和人工智能技術(shù)的引入顯著提升了糖蛋白質(zhì)組學(xué)的分析能力，使研究進(jìn)入了高精度、高效率的新階段。未來，糖蛋白質(zhì)組學(xué)將不斷拓展其在基礎(chǔ)科學(xué)和臨床研究中的廣泛應(yīng)用，深刻改變我們對生物系統(tǒng)、疾病機(jī)制及其治療的理解，并為個(gè)性化醫(yī)療和早期疾病診斷提供更加精準(zhǔn)的工具和策略。

復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院碩士生陳樂晗為本文第一作者，曹緯倩副研究員為通訊作者。相關(guān)研究得到了國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2024YFA1306300）, 國家自然基金委面上項(xiàng)目（32271490）資助。

文章信息

陳樂晗, 劉佳林, 曹緯倩, 位點(diǎn)特異性糖基化蛋白質(zhì)組學(xué)研究回顧與展望, 科學(xué)通報(bào), Volume 70, Issue 15, 2025, Pages 2302-2318, ISSN 0023-074X, https://doi.org/10.1360/TB-2024-1409.

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