出生于湖北省孝感市漢川市楊林鎮(zhèn)的劉蘭，曾經(jīng)歷過高考考入武漢大學的順遂，也經(jīng)歷過耗時 7 年在中國科學院生物物理研究所完成碩博連讀的經(jīng)歷，亦經(jīng)歷過在中山大學醫(yī)學院從事博士后期間“僅以共同一作身份發(fā)表了一篇論文”，再到在美國國立衛(wèi)生研究院從事博士后期間以第一作者身份發(fā)表一篇Molecule Cell和一篇Nature

最近，她的這篇Nature一作論文順利付梓。她告訴 DeepTech：“一路走來，我走了一枚‘學渣’平凡的成長之路。幸運的是，我在 2021 年和 2024 年各收獲了一個孩子，為這平凡之路又增添了許多酸甜苦辣和雞飛狗跳。目前，我還是博士后身份，還有一篇論文需要收尾。暫時打算 2026 年年底回國，目前還在找工作中。”

圖 | 劉蘭（來源：劉蘭）

在這篇Nature論文之中，劉蘭和所在團隊通過解析兩個高分辨率復合物結(jié)構(gòu)并結(jié)合功能實驗揭示了非同源末端連接如何修復 DNA 末端帶有缺口的 DNA 雙鏈斷裂。這個修復過程可以分為兩個步驟：第一步聚合酶補齊 DNA 缺口（gap-filling），第二步連接酶連接斷口（nick ligation）。

高分辨率數(shù)據(jù)給研究團隊提供了很多重要信息，其中最重要的兩點是：（1）聚合酶的招募機制，（2）連接酶和聚合酶的協(xié)同反應機制。以前，人們認為不同的酶采取競爭方式獨立結(jié)合 DNA 末端并對 DNA 進行相應的修復。然而，本次研究顯示連接酶始終結(jié)合兩條斷掉的 DNA 末端，其功能不僅作用于最終的連接階段，也在 DNA 末端加工階段輔助其它加工酶結(jié)合到 DNA 末端。因此，本次研究確認了連接酶在非同源末端連接途徑中具有多重核心功能，完善了這條通路的功能機制模型。

（來源：Nature）

非同源末端連接是 DNA 雙鏈斷裂的主要修復方式，其功能異常與許多疾病相關(guān)。比如，許多癌細胞中均發(fā)現(xiàn)非同源末端連接蛋白表達水平上調(diào)，抑制非同源末端連接可以增加癌細胞對化療的敏感性。目前，已有針對非同源末端連接抑制劑的藥物研發(fā)，大多針對蛋白激酶 DNA-PK 和連接酶 LIG4。然而，這類抑制劑的特異性是目前需要克服的主要難題，而針對蛋白相互作用的藥物設(shè)計不失為另一種可能的選擇。

研究團隊的高分辨率結(jié)構(gòu)模型清晰地顯示了非同源末端連接核心蛋白形成了一個修復平臺，招募不同的功能酶協(xié)同完成 DNA 修復；阻礙蛋白間關(guān)鍵的相互作用則可能導致這個修復平臺不能形成或運轉(zhuǎn)不暢。因此，本次研究結(jié)果為針對非同源末端連接抑制劑的設(shè)計提供了精確的靶標模型。

另一方面，一些病人由于攜帶非同源末端連接基因突變，導致遭受多種疾病的折磨，如嚴重的聯(lián)合免疫缺陷病、發(fā)育障礙、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、癌癥等。根據(jù)研究團隊解析的非同源末端連接復合物結(jié)構(gòu)模型，可以在分子層面分析部分突變體的發(fā)病機制，從而為精準醫(yī)療提供依據(jù)。

揭示聚合酶的新秘密

基因組 DNA 儲存著生命的遺傳密碼，包含了指導蛋白質(zhì)和 RNA 生成的所有指令。因此，維持基因組 DNA 穩(wěn)定性對個體生存和物種繁衍至關(guān)重要。然而，每時每刻 DNA 都受到各種外源和內(nèi)源因素的干擾而產(chǎn)生損傷。比如，紫外線會造成皮膚細胞 DNA 損傷，X 射線等電離輻射也可以導致 DNA 鏈斷裂、堿基改變等。所幸細胞擁有一系列復雜的 DNA 損傷修復通路，包括堿基切除修復、核苷酸切除修復、錯配修復、DNA 雙鏈斷裂修復等，從而得以維持基因組的穩(wěn)定性。

在眾多 DNA 損傷類型中，DNA 雙鏈斷裂對細胞的危害最大，若不能及時且正確的修復，則可能引起 DNA 大片段丟失、突變或重排，大大增加細胞死亡或癌變的風險。深入了解 DNA 損傷修復機制，不僅是對生命的探索，也是為相關(guān)疾病的治療甚至預防提供理論依據(jù)。

多年來，劉蘭的導師美國國立衛(wèi)生研究院馬丁·蓋勒特（Martin Gellert）教授和楊薇教授深耕 DNA 損傷修復領(lǐng)域。其中，DNA 雙鏈斷裂（DSB，double-strand break）修復是研究團隊的一個重點研究方向。非同源末端連接（NHEJ，non-homologous end joining）則是最重要的 DNA 雙鏈斷裂修復途徑之一，負責修復大于 80% 的 DNA 雙鏈斷裂；另外，非同源末端連接還是抗體和 T 細胞受體基因形成過程中必不可少的一環(huán)。因此，非同源末端連接受損的病人往往有不同程度的免疫疾病。

（來源：Nature）

非同源末端連接途徑大致可分為 DNA 斷口識別、斷口加工和連接三個步驟，由 30 多種蛋白協(xié)同完成。這些蛋白根據(jù)功能的不同被分為核心蛋白、末端加工蛋白和輔助蛋白。其中核心蛋白的研究最為深入，它們可獨立修復含平末端或粘性末端的 DNA 雙鏈斷裂。然而，真實的 DNA 雙鏈斷裂損傷往往伴隨著 DNA 末端堿基或結(jié)構(gòu)破壞，需要加工酶（核酸酶、聚合酶、末端修正酶等）處理后才能被連接酶識別，而這部分的研究相對匱乏。因此，研究團隊以聚合酶為研究對象，旨在揭示聚合酶如何被招募參與非同源末端連接并與其它蛋白協(xié)同完成 DNA 雙鏈斷裂修復。

自行挑錯“震驚”審稿人

劉蘭表示：“這個課題從 2022 年開始，2024 年 7 月投稿，2025 年 4 月論文被Nature接受。”累計耗時大約三年左右。

在研究第一階段，他們重組表達并純化相關(guān)的非同源末端連接蛋白，并一共獲得 8 種非同源末端連接蛋白，有些使用簡單的原核體系表達，有些則需要使用哺乳細胞表達系統(tǒng)。由于研究團隊實驗室一直在做 DNA 損傷修復方面的工作，因此純化這些蛋白并沒有花費太多時間。

在研究的第二階段，他們篩選了參與 gap-filling 和 ligation 的蛋白成分。研究團隊用不同的蛋白組合做酶活實驗來觀察哪種組合能最高效的完成 DNA 修復，從而確定哪些蛋白能夠形成功能復合物。

在研究的第三階段，研究團隊針對實驗條件進行優(yōu)化，例如緩沖液的離子濃度、pH 值、添加劑等，從而得到更高的酶活效率，因為更高的酶活預示著可能有更多的蛋白形成了功能復合物。

在研究的第四階段，他們根據(jù)酶活實驗確定的條件，用單顆粒冷凍電鏡技術(shù)捕捉復合物。這個復合物涉及 16 條蛋白鏈、大約 1MDa 分子量。其主體結(jié)構(gòu)松散、各部分之間柔性很大。直接冷凍樣品并不能得到完整復合物，為此，研究團隊使用了交聯(lián)劑穩(wěn)定復合物，并通過交聯(lián)劑濃度優(yōu)化和凍樣條件優(yōu)化，最終將分辨率推至 3? 左右，足夠他們搭建精準的結(jié)構(gòu)模型。

在研究的第五階段，他們針對模型提供的結(jié)構(gòu)信息做了一些功能實驗，使得結(jié)構(gòu)與功能相互支撐，從而使本次結(jié)論更加可信。

但是，劉蘭表示：“我覺得比較幸運的是我們在論文返修階段發(fā)現(xiàn)了一個致命疏漏，避免了論文發(fā)表后再更正或撤稿的尷尬。”

三位審稿人的第一輪意見特別正面，唯一的一個主要關(guān)切是研究團隊的生化實驗結(jié)果中 XRCC4 類因子（XLF，XRCC4 like factor）蛋白功能偏弱，與以前發(fā)表的論文結(jié)果不完全一致。返修時，研究團隊花了兩個月的時間反復重復實驗或優(yōu)化實驗條件，但始終只能重復之前的結(jié)果。

通過對各種因素逐一排查，最終發(fā)現(xiàn)他們使用的 XLF 蛋白 C 末端降解了 20 多個氨基酸導致 XLF 功能受損。這個蛋白表達時融合了麥芽糖結(jié)合蛋白（MBP，Maltose-Binding Protein）純化標簽，在純化過程中需使用 PreScission 蛋白酶將 MBP 標簽切除。讓人意外的是 XLF 序列中含有一個弱的 PreScission 蛋白酶識別位點，導致 XLF C 末端也被意外切除。由于這個截斷體與全長蛋白的分子量很接近，研究團隊并沒有通過 SDS-PAGE 膠或分子篩出峰位置發(fā)現(xiàn)其異常，這也導致了功能實驗結(jié)果與相關(guān)文獻的結(jié)果有點出入。

發(fā)現(xiàn)問題之后，他們優(yōu)化了純化方法并得到了全長 XLF 蛋白。果不其然，全長 XLF 蛋白促進非同源末端連接效率的功能大大增強。于是，研究團隊又花費四個月時間，用全長蛋白將所有的結(jié)構(gòu)和功能實驗全部重做。“所幸那個降解片段并沒有影響復合物的全局構(gòu)象，對論文結(jié)論沒有影響。”劉蘭表示。

由于蛋白純化的這點疏忽，導致一個“小修”的論文變成了重做。“返修后，審稿人也被我們的操作震驚了，并感嘆于如此之大的工作量。這個教訓讓我深刻體會到魔鬼確實藏在細節(jié)中，往后切不可麻痹大意。”劉蘭說。

最終，相關(guān)論文以《動態(tài)組裝與非同源末端連接協(xié)同反應》（Dynamic assemblies and coordinated reactions of non-homologous end joining）為題發(fā)在Nature，劉蘭是第一作者，馬丁·蓋勒特（Martin Gellert）教授和楊薇教授擔任共同通訊作者。

圖 | 相關(guān)論文（來源：Nature）

如前所述，本次研究結(jié)果顯示非同源末端連接核心蛋白會形成一個修復平臺，招募不同的酶參與修復 DNA 損傷末端。目前，研究團隊研究了聚合酶的作用機制。基于此，該團隊計劃進一步完成其它末端修復酶的組裝和協(xié)同機制研究，以便全面揭示 NHEJ 這一重要復雜且精妙的分子過程。

參考資料：

1.Liu, L., Li, J., et al. Dynamic assemblies and coordinated reactions of non-homologous end joining.

Nature

(2025). https://doi.org/10.1038/s41586-025-09078-9

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