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許多疾病的發生與異常的基因突變有關，當突變發生在基因外顯子區域時，會直接導致基因編碼的蛋白序列紊亂，產生的蛋白可能功能失調或造成細胞毒性。通常情況下，科學家會嘗試清除或中和掉已經形成的有害蛋白，來減輕疾病嚴重程度；此外，另一項策略則是直接對出現錯誤的DNA片段進行編輯和修改，讓蛋白編碼重回正軌。

來自伊利諾伊大學厄巴納-香檳分校的Pablo Perez-Pinera教授長期致力于基因編輯相關的研究，但與直接改變錯誤序列的常規方式不同，他與同事認為跳過錯誤的外顯子區域或許同樣具備治療潛力。Perez-Pinera教授用做菜作了一個比喻：當菜譜上出現一個材料錯誤時，直接按配方做可能會產生奇怪的味道甚至有毒；但如果只是跳過這種材料，食物最終只是缺乏了某種風味但仍可食用。

圖片來源： 123RF

在近期的《自然-通訊》雜志上，Perez-Pinera教授和同事就展示了這樣一種特殊的基因編輯工具SPLICER，它在CRISPR/Cas9的基礎上改造而來，能夠實現對特定外顯子的直接跳躍。研究在阿爾茨海默病致病相關基因——淀粉樣前體蛋白（APP）編碼基因上對SPLICER的效果進行了測試，結果顯示SPLICER可以有效減少毒性淀粉樣β蛋白生成，并且沒有產生脫靶效應。在經過處理的小鼠體內，目標外顯子水平減少了25%。

根據論文介紹，在CRISPR/Cas9編輯工具中，與目標DNA序列相鄰的一小段DNA序列被稱作原間隔序列鄰近模塊序列（PAM），它對于Cas9蛋白識別靶序列很關鍵。但同時，過度依賴PAM來實現編輯功能，也在一定程度上限制了CRISPR/Cas9在更多外顯子場景中發揮作用。

在新研究中，作者對各種更新版本的Cas9酶進行了測試和分析，他們挑選了一類SpRY Cas9酶。相較于野生型Cas9，這種酶的優勢是對PAM的依賴度很低，可以編輯更多數量的靶標。

▲SPLICER可以實現更高效的外顯子跳躍（圖片來源：參考資料[1]）

此外，在外顯子起始兩端分別存在一個關鍵序列區域，能夠保證細胞自體的基因機制來判斷外顯子的位置。過往的外顯子跳躍工具通常會靶向其中一個序列，這樣可能會遺漏掉一些目標外顯子，或者沒有完整地實現跳躍。而SPLICER則可以同時靶向外顯子起始兩端的序列，有效提升了外顯子跳躍效率。作者測試了SPLICER在數個外顯子中的效果，以JAG1外顯子為例，與只靶向外顯子一側序列相比，SPLICER的外顯子跳躍率提升了28%~37%。

隨后，研究進一步探索了SPLICER在疾病場景下的應用價值，他們關注了與阿爾茨海默病發生密切相關的APP基因，并選擇性地跳過了APP的外顯子17。通常情況下，APP蛋白會被β/γ分泌酶處理生成Aβ42多肽，而這個切割位點恰好位于APP外顯子17區域。

根據分析結果，SPLICER同樣可以比單獨靶向工具更有效地跳躍APP外顯子17，同時SPLICER可以將異常剪接事件減少50%以上，避免過早出現終止密碼子，或部分保留內含子的不利影響。此外，SPLICER可以使細胞中的Aβ42水平下降約70%。在AD模型小鼠中，作者借助腺相關病毒載體將SPLICER注射到了小鼠的海馬體中，這種方式可以使APP外顯子17減少約25%，有效減少了Aβ42多肽在海馬體中的產生。

研究團隊總結道，外顯子跳躍可以在新產生的蛋白仍然維持功能的情況下使用。對于阿爾茨海默病、帕金森病，這種方法具有很大的治療潛力，可以幫助避免有害蛋白在大腦中過度累積。

參考資料：

[1] Miskalis, A., Shirguppe, S., Winter, J. et al. SPLICER: a highly efficient base editing toolbox that enables in vivo therapeutic exon skipping. Nat Commun 15, 10354 (2024). https://doi.org/10.1038/s41467-024-54529-y

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