口服給藥具有無創性，是一種理想的給藥途徑，但對于許多類型的化合物仍不可行。如果靶點在腸道內，該藥物必須能夠在上消化道（GIT）的酸性和蛋白水解條件下生存，并可能被微生物蛋白酶降解。這使得口服生物藥物具有挑戰性。

噬菌體（phages）是一種原核病毒，以在感染過程中將宿主機制導向噬菌體編碼基因的表達而聞名。本研究提出一個假設，即一種治療性蛋白可以被編碼到一個毒性噬菌體中，從而在一個常駐腸道細菌感染過程中與噬菌體基因共表達，然后通過噬菌體誘導的細胞裂解釋放到細胞外。此外，還假設噬菌體-細菌的共存將導致噬菌體編碼基因的持續產生。

在此，弗吉尼亞理工學院Bryan B. Hsu和Liwu Li證明了基因工程毒性噬菌體可以用來重新編程細菌來表達和釋放治療性蛋白。相關研究內容以“Sustained in situ protein production and release in the mammalian gut by an engineered bacteriophage”為題發表在《Nature Biotechnology》。首先，本研究證明了當超折疊綠色熒光蛋白（sfGFP）基因在宿主細菌和噬菌體的基因組中被編碼時，強毒性噬菌體T4將大量細胞內產生的熒光標記蛋白sfGFP釋放到培養裂解液中。然后，通過小鼠模型表明，單劑量編碼sfGFP基因的噬菌體可以在小鼠黏膜中大量原位產生sfGFP。最后，在兩個小鼠模型中證明了本研究提出的方法的可行性。

在第一個模型中，使用T4噬菌體表達絲氨酸蛋白酶抑制劑B1a（serpin B1a）蛋白抑制促炎酶中性粒細胞彈性蛋白酶（NE）的活性，該酶在結腸炎過程中上調。在第二個模型中，使用T4噬菌體表達蛋白ClpB，蛋白ClpB具有一個不連續的5個氨基酸基序，與厭食神經肽α-促黑激素（α-MSH）同源，可以誘導飽腹感以減少肥胖期間的體重增加。研究發現，在飲食誘導肥胖（DIO）小鼠模型中，設計表達ClpB的T4噬菌體可以減少體重增加。總之，本研究表明，毒性噬菌體可以用來表達和釋放對哺乳動物宿主具有生理作用的異源蛋白。

研究內容

如圖1a所示，假設細菌被一個強毒性噬菌體感染會使細胞內蛋白釋放到細胞外環境中。將T4噬菌體與表達sfGFP基因的大腸桿菌K-12菌株孵育。在后文中用“sfgfp”表示該基因，用“sfGFP”表示sfgfp基因的蛋白產物。如圖1b所示，與不含噬菌體培養的細菌（~7×103 AU/OD）相比，含T4噬菌體的熒光大腸桿菌培養物在上清液中每個細胞有更多的熒光（~0.5-1.0×106AU/OD）。以上數據表明T4噬菌體促進細胞內蛋白釋放到細胞外。

圖1 噬菌體誘導的細菌裂解釋放細胞內蛋白質

接下來量化在細菌細胞感染過程中是否可以產生并釋放大量噬菌體編碼的異源蛋白。早期T4噬菌體啟動子轉錄優于宿主啟動子，部分原因是前者啟動子強度更大，宿主RNA聚合酶修飾優先轉錄T4啟動子。這最終導致噬菌體啟動子在連續階段的轉錄（圖2a），以優化活病毒顆粒的組裝。本研究生成一個重組T4噬菌體小文庫，其中包含驅動sfgfp基因表達的選定啟動子（圖2b），并將該結構插入一個已用于T4重組的非必要假設膜蛋白（ac基因）中。在大腸桿菌K-12中培養12 h后，用熒光法測定上清液中釋放的sfGFP蛋白。與缺乏sfgfp基因的非工程T4噬菌體（野生型）相比，缺乏啟動子（無啟動子）或使用強組成型大腸桿菌啟動子（J23119）并沒有導致更多的sfGFP熒光（圖2c）。與野生型T4噬菌體相比，編碼這些啟動子的噬菌體滴度降低大約兩倍，但沒有統計學意義（圖2d）。基于最大sfGFP水平和對噬菌體滴度影響最小的標準，在接下來的實驗中使用gp22啟動子。

圖2 T4噬菌體啟動子對體外生產sfGFP的研究

如圖3a所示，在飲用水中提供鏈霉素，用單劑量的大腸桿菌定植，然后給予野生型T4噬菌體或T4：：sfgfp噬菌體。細菌和噬菌體共定植4天后，發現兩者都大量存在（圖3b）。熒光顯微鏡對未固定腸切片黏膜的熒光定量顯示，T4：：sfgfp噬菌體定植的小鼠比野生型T4噬菌體定植的小鼠的GFP熒光顯著增加（圖3c）。由于自身熒光，野生型T4噬菌體具有低水平熒光，而T4：：sfgfp噬菌體具有大量粘膜熒光（圖3d、e）。為進一步驗證GFP熒光定位于粘膜，固定腸道樣本，用WGA和UEA I對DAPI和粘蛋白進行染色。結果顯示，野生型T4噬菌體定植小鼠黏膜中的FITC通道熒光與組織的自身熒光相比沒有明顯變化（圖3f）。在更高的放大倍數下，通道分離（圖3g-j）。相比之下，用T4：：sfgfp噬菌體定植的小鼠有大量的黏膜GFP熒光（圖3k）。更高的放大倍數（圖3l）證實GFP熒光（圖3m）增加，共定位于組織管腔側的粘膜（圖3n），遠離細胞核（圖3o）。綜上結果表明，由噬菌體特異性啟動子驅動的異源基因在噬菌體繁殖過程中可以大量表達。

圖3 通過工程噬菌體在體內產生sfGFP

為了檢測T4：：serpin噬菌體產生的serpin在哺乳動物腸道中的有效性，使用化學誘導的結腸炎小鼠模型（圖4a）。如圖4b、c所示，糞便中的大腸桿菌和噬菌體水平在實驗期間持續存在，而野生型T4和T4：：serpin之間沒有顯著差異。第9天T4：：serpin處理的小鼠體重顯著增加（圖4d），且糞便NE活性顯著降低（圖4e）。對結腸中性粒細胞的分析顯示，不同噬菌體條件下的中性粒細胞密度相似（圖4f），但來自T4：：serpin處理小鼠的中性粒細胞富含CD24標記物（圖4g）。

圖4 通過Serpin的產生減弱DSS誘導的結腸炎

為了確定基于噬菌體方法原位產生ClpB是否會對宿主產生生理相關的影響，使用如圖5a所示的DIO小鼠模型。糞便噬菌體滴度顯示，野生型T4和T4：：clpB噬菌體均能在小鼠腸道中保持定植（圖5b）。盡管引入了野生型T4或T4：：clpB噬菌體（圖5c），糞便大腸桿菌濃度也顯示出持續的定植（圖5c），突出噬菌體和細菌之間的共存。為深入了解觀察到的噬菌體和細菌共存的潛在機制，將糞便大腸桿菌菌落與噬菌體進行交叉雜交，以確定噬菌體抗性的頻率。如圖5d、e所示，與野生型T4培養的大腸桿菌相比，T4：：clpB噬菌體培養的大腸桿菌中抗α-MSH抗體的標記更明顯。抗α-MSH抗體通過交叉反應與ClpB結合。在本實驗過程中，與沒有噬菌體或野生型T4噬菌體定植的小鼠相比，有T4：：clpB噬菌體定植的小鼠體重顯著降低（圖5h）。用T4：：clpB噬菌體定植小鼠的食物消耗量減少（圖5I），這與夜間活動增加有關（圖5j）。DIO在小鼠模型中導致炎癥。與野生型T4噬菌體相比，T4：：clpB噬菌體定植的小鼠中的幾種促炎細胞因子減少，例如IL-1α和IL-1β。其他細胞因子也有所減少，包括單核細胞趨化蛋白1（MCP-1）、IL-17A和粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF），但未達到統計學意義（圖5k）。

圖5 T4：：clpB對減少食物消耗和體重增加的功效

小結

綜上所述，本研究表明在正常的噬菌體感染過程中，工程毒性噬菌體T4可以利用與細菌宿主的共存產生持續的原位效應，協調哺乳動物腸道中異源蛋白的產生和釋放。通過工程T4噬菌體在晚期T4噬菌體啟動子gp22下表達sfgfp，發現該報告蛋白在體內和體外均顯著表達。T4產生的蛋白酶抑制劑serpin B1a可以降低結腸炎期間小鼠腸道中的NE活性。最后，研究發現ClpB蛋白的表達可以顯著減少DIO小鼠模型中的體重增加。總之，本研究是一個概念證明的驗證，即工程毒性噬菌體可以用于原位生產異源蛋白。

參考文獻：Baker, Z.R., Zhang, Y., Zhang, H. et al. Sustained in situ protein production and release in the mammalian gut by an engineered bacteriophage. Nat Biotechnol (2025). https://doi.org/10.1038/s41587-025-02570-7

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