作為表觀遺傳學的重要修飾，DNA甲基化廣泛存在于原核與真核生物中，并發揮關鍵調控作用。在原核生物中，DNA上胞嘧啶（Cytosine, C）的第四位氮元素可被甲基化修飾形成N4-甲基胞嘧啶（4mC）、第五位碳元素可被甲基化修飾形成C5-甲基胞嘧啶（5mC），腺嘌呤的第六位氮元素可被甲基化修飾形成N6-甲基腺嘌呤（6mA），雖然基因組上甲基化程度不高（大腸桿菌中，約0.5%-0.8%的胞嘧啶，1.5%-2%的腺嘌呤會被甲基化修飾），但DNA甲基化依然發揮著重要的作用，參與調控基因表達和防御反應。然而，在真核生物中，迄今僅發現5mC在基因組上廣泛分布，6mA在單細胞生物中有零星分布，而4mC是否存在則仍有很大爭議。

在真核生物中，DNA甲基轉移酶Dnmt1和Dnmt3介導5mC的甲基化過程，該機制在各物種中高度保守。不同物種的5mC分布有所差異：在脊椎動物中，5mC主要發生在全基因組范圍內的CG位點，約80%的CG在人體組織中被甲基化為5mCG；而在開花植物中，5mC則主要發生在轉座子區域（Transposon Elements, TE），并存在在CG、CHG和CHH（H代表A、C或T）位點。在動植物的發育過程中，5mC水平在很大程度上保持穩定，一旦紊亂常導致嚴重發育異常和疾病。然而，在哺乳動物和開花植物的雄性生殖細胞（精子）發育過程中，5mC會經歷重編程，這對精子成熟至關重要。

4月9日，奧地利科學技術研究所(Institute of Science and Technology Austria)馮小琦團隊在Cell發表了題為Extensive N4 Cytosine Methylation is Essential for Marchantia Sperm Function的研究論文，首次證明了4mC在真核生物中的存在，并詳實地闡明，在精子成熟階段，基因組上發生了廣泛的4mC修飾，這對于精子發育與功能至關重要。

研究發現，4mC在陸地植物地錢 (

Marchantia polymorpha

Marchantia polymorpha

圖1地錢精子發育過程中甲基化重編程及4mC作為功能性DNA修飾的作用機制

進一步研究發現，全基因組范圍內，精子基因組的DNA甲基化水平從營養組織(Thallus)的17%顯著上升至成熟精子(Mature sperm)的96%。為了研究這一顯著的DNA甲基化變化過程，作者分離了不同發育階段的精子前體細胞群，結合轉錄組、甲基化組和發育時期同步分析精子發育過程中的DNA甲基化水平的變化。結果顯示，在精子發育過程中，除轉座子區外的基因組范圍內，有兩波(two waves)不同的DNA甲基化修飾的發生，第一波發生在non-CG上，而后第二波發生在CG上。這種全基因組的DNA甲基化修飾與精子的成熟過程高度相關，并且這種現象并不存在于受精后的胚胎 （Embryo，圖2）。

圖2 精子發育過程中兩次廣泛的DNA甲基化重編程。A，熱圖顯示了野生型Tak1不同組織中染色體上10 kb窗口的甲基化情況；B，條形圖顯示了不同組織中具有明顯甲基化的100 bp基因組窗口的百分比。

結合轉錄組和遺傳學分析，作者發現了兩個5mC甲基轉移酶（MpDNMT3b和MpCMTa）在精子發育過程中表達量升高，并進而確認了他們參與調控發生在non-CG的5mC甲基化的重編程（first wave，第一波），但不負責發生在CG上的重編程（second wave，第二波）（圖3）。

圖3 精子發育過程中non-CG甲基化重編程由5mC甲基轉移酶MpDNMT3b和MpCMTa介導誘導。A，MpDNMT3b和MpCMTa在不同組織中的轉錄水平。TPM表示每百萬轉錄本數量。B，條形圖展示了在野生型(WT)、Mpdnmt3b敲低(kd)和Mpcmta敲低(kd)精子中，CG、CHG或CHH甲基化水平大于0.3的100 bp基因組窗口的百分比。

雖然沒有任何5mC甲基轉移酶的表達和精子的第二波重編程相關，但令人興奮的是，作者發現了兩個全新的甲基轉移酶MpDN4MT1s (M. polymorpha DNA 4mC Methyltransferase1a and 1b, MpDN4MT1a and MpDN4MT1b)。MpDN4MTs不與5mC甲基轉移酶同源，但和原核生物的4mC甲基轉移酶高度同源。他們在精子發育后期特異表達，暗示他們可能負責第二波發生在CG上的DNA甲基化重編程。作者通過點雜交(Dot blot)，液相質譜(LC-MS)，和遺傳學方法，檢測并證實了成熟精子中存在4mC修飾，并且是由MpDN4MT1a介導產生的（圖4）：

圖4 地錢精子中廣泛存在4mC，且依賴于MpDN4MT1a。A，MpDN4MT1a和MpDN4MT1b在不同組織中的轉錄水平；B，系統進化樹展示了與兩種MpDN4MT1s同源的原核生物5mC和4mC甲基轉移酶；C，用4mC抗體進行DNA點雜交免疫檢測；D，LC-MS檢測甲基化脫氧胞苷標準品和從不同樣本中提取的DNA酶解后甲基化脫氧胞苷的峰圖。

因為經典的檢測DNA甲基化程度的重亞硫酸鹽測序 (Bisulfite Sequencing, BS-seq) 不能區別4mC和5mC，所以作者進一步通過單分子實時測序(SMRT-seq)、TET酶輔助的重亞硫酸鹽測序技術 (4mC-TAB-seq)、APOBEC介導的脫氨基測序技術(4mC-AMD-seq)和遺傳學分析，證實了第二波發生在CG上的甲基化實則是4mC甲基化，由MpDN4MT1a介導，覆蓋精子基因組50%以上的CG位點，為真核生物中4mC的存在提供了強有力證據（圖5）。

圖5 4mC發生于CG位置并富集于基因區域。A，小提琴圖展示在WT和Mpdn4mt1-1精子中，通過BS-seq，SMRT-seq和4mC-AMD-seq檢測到的100-bp基因組窗口的重復序列(Repeats)和非重復序列(Non-repeats)的甲基化情況；B，展示WT和Mpdn4mt1-1精子中部分基因和轉座子序列的CG甲基化的情況。

此外，作者通過CRISPR-Cas9敲除MpDN4MT1a基因，發現突變體精子的染色體可及性增強以及轉錄組紊亂，并表現出精子游動異常（速度減慢、不定向），育性有缺陷，影響受精后發育。這些結果表明4mC在精子發育和功能中具有關鍵作用（圖6）。

圖6 4mC對精子功能和受精后發育至關重要。A，Mpdn4mt1-1突變與WT精子中基因和轉座元件(TEs)差異可及性（通過ATAC-seq測量）的概況；B，火山圖展示了Mpdn4mt1-1與WT精子相比，上調（綠色）或下調（紅色）的轉錄本。C，Mpdn4mt1-1與WT精子游動路徑；D、E，不同材料中精子活動的方向性和速度的統計結果；F，不同材料中異常胚胎的百分比；G，不同材料中胚胎成熟所需的天數。

作者同時還揭示了地錢精子發育中的兩波DNA甲基化重編程過程，該過程最終形成了特有的全基因組甲基化修飾模式（覆蓋率97%）（圖7）。

圖7. 地錢精子發育過程中甲基化重編程的時間模式與機制

綜上，該研究首次證實了4mC在真核生物中的存在，揭示了在地錢精子成熟過程中基因組范圍內編碼區的大規模4mC修飾，保障了精子的正常發育和正常功能，對精子命運的重要決定性，發現并鑒定了負責4mC修飾的真核4mC甲基轉移酶。此研究拓展了真核生物中表觀遺傳學的認知，發現了參與生殖發育過程至關重要的表觀遺傳學新修飾，開創了4mC在真核生物中功能的研究新方向，拓展了表觀遺傳學領域的邊界。

該論文的通訊作者為現任奧地利科學技術研究所（ISTA），前任英國John Innes Centre (JIC) 的馮小琦教授。James Walker(JIC, 現任職于The Salk Institute)、張靜懿（JIC，現任職于華南農業大學農學院）、劉亞林（JIC，現任職于華南農業大學生命科學學院）和許淑娟（ISTA）為本文共同第一作者。于義溟 (ISTA) 、Martin Vickers (JIC) 、歐陽維枝(ISTA) 、Judit Tálas (JIC) 、Liam Dolan (Gregor Mendel Institute of Molecular Plant Biology)、Keiji Nakajima (Nara Institute of Science and Technology) 參與了研究。

論文鏈接：

https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(25)00287-9