肺腺癌（LUAD）是全球致死率最高的癌癥之一，而腫瘤微環境中的免疫細胞如何影響癌癥進展，一直是科學家探索的焦點。2024年3月發表在 cell reports medicine 上標題為An immune cell map of human lung adenocarcinoma development reveals an anti-tumoral role of the Tfhdependent tertiary lymphoid structure。中國科研團隊通過單細胞測序技術，首次繪制肺腺癌從早期到晚期的免疫細胞動態圖譜，解構三級淋巴結構（TLS）——它由 Tfh 細胞、B 細胞和功能失調的CD8+ T 細胞組成，竟能顯著抑制腫瘤生長，甚至與患者生存率直接掛鉤！

更驚人的是，破壞這種結構的小鼠腫瘤瘋狂生長，而激活其核心信號通路（IL-21）則可能成為未來治療的新靶點。這不僅是癌癥免疫研究的里程碑，更為千萬患者點亮了希望之光！為什么這種結構能“逆天改命”？它如何從無到有形成抗癌防線？答案藏在腫瘤與免疫細胞的「對話」中……

實驗方法及結果：

圖1：肺腺癌（LUAD）發展過程中免疫細胞的單細胞轉錄組圖譜

實驗方法：對34例正常肺組織、4例原位腺癌（AIS）、22例微浸潤腺癌（MIA）和33例浸潤性腺癌（IAC）樣本進行單細胞RNA測序（scRNA-seq）。通過歐幾里得距離分析比較不同階段樣本的免疫微環境差異。結果：正常肺與腫瘤樣本的免疫細胞組成存在顯著差異，且隨著腫瘤進展（從AIS到IAC），免疫微環境的異質性逐漸增加：提示腫瘤侵襲導致免疫細胞動態顯著改變。

圖2：LUAD進展中免疫細胞組成的動態變化

實驗方法：通過流式細胞術（FACS）驗證不同階段免疫細胞的比例變化。計算細胞毒性基因（如GZMB）和抑制性受體基因（如PDCD1）的活性評分。對CD8+ T細胞進行軌跡分析，探究其分化狀態。結果：CD4+ T細胞和B細胞在IAC階段顯著增加，而NK細胞和單核細胞減少。CD8+ T細胞的功能狀態逐漸從細胞毒性（CTL）向功能失調（高表達CXCL13）轉變。功能失調的CD8+ T細胞和Tfh樣細胞通過局部增殖和克隆擴增增加。

圖3：B細胞在腫瘤內的增殖與分化

實驗方法：多色免疫熒光染色（CD19、CD4、CD8）觀察B細胞和T細胞的空間分布。對B細胞亞型（如GC B細胞、記憶B細胞）進行scRNA-seq亞群分析。結合TCGA數據庫驗證B細胞亞型的表達特征。結果：B細胞在IAC階段形成聚集結構，且主要亞型為GC B細胞和CD27+記憶B細胞。腫瘤內的B細胞通過局部增殖（Ki67+）和分化（從GC B細胞到漿細胞）增加。TCGA數據中，高表達CD27和CD83的活化記憶B細胞與IAC階段顯著相關。

圖4：Tfh樣細胞與B細胞的相互作用及TLS形成

實驗方法：基因共表達分析（如CXCL13-CXCR5、IL-21-IL-21R）驗證Tfh樣細胞與B細胞的相互作用。免疫熒光染色（CD20、CD4、CXCL13）觀察TLS的結構。利用TCGA數據分析TLS相關基因表達與患者預后的關聯。結果：Tfh樣細胞高表達CXCL13和IL-21，與GCB細胞共定位形成TLS。TLS內含CD21+濾泡樹突狀細胞和PNAd+高內皮小靜脈，結構類似次級淋巴器官。高TLS評分的患者生存率顯著優于低評分患者（p<0.05）。

圖5：TLS在腫瘤發展中的動態形成過程

實驗方法：多色免疫熒光染色（CD4、CD20、CD21）分析不同階段腫瘤的TLS結構。定量計算TLS密度及面積占比。結果：TLS形成分為三個階段：IAC階段的mTLS比例顯著高于AIS和MIA（p<0.01）。

圖6：TLS的臨床意義及功能驗證

實驗方法：利用TCGA數據對TLS相關基因進行生存分析。構建小鼠模型（KPC肺癌模型、CD4CRE;Bcl6fl/fl小鼠）驗證Tfh和B細胞的功能。用抗IL-21R抗體阻斷IL-21信號通路。結果：高表達Tfh樣細胞或GC B細胞基因特征的患者總生存期更長（p<0.05）。Tfh或B細胞缺失的小鼠腫瘤生長加速，TLS數量減少。阻斷IL-21R信號后，TLS的形成和抗腫瘤效應被抑制，證實IL-21-IL-21R是TLS功能的關鍵通路。

本文通過單細胞測序構建了LUAD發展中的免疫動態圖譜，結合多色免疫熒光和空間分析揭示TLS的形成過程，利用TCGA數據和小鼠模型驗證了TLS的臨床意義與功能機制。實驗設計覆蓋從分子機制到臨床預后的多層次驗證，值得借鑒。