撰文丨章臺(tái)柳

表觀轉(zhuǎn)錄組標(biāo)記N6-甲基腺苷（m6A）調(diào)控mRNA的加工與代謝過(guò)程，包括前體mRNA剪接、成熟mRNA的核輸出、定位及翻譯等環(huán)節(jié)。但目前最明確的m?A功能是對(duì)mRNA降解的調(diào)控作用。m?A由甲基轉(zhuǎn)移酶核心復(fù)合體（MTC）共轉(zhuǎn)錄修飾，該復(fù)合體包含METTL3、METTL14、WTAP及輔助因子RBM15、VIRMA、CBLL1和ZC3H13。MTC能與RNA聚合酶II、修飾的組蛋白H3K36及轉(zhuǎn)錄輔因子相互作用。在新生RNA中，復(fù)合體的催化亞基METTL3會(huì)甲基化DRACH序列基序（D代表A/G/T；R代表A/G；H代表A/C/T）。值得注意的是，轉(zhuǎn)錄組中僅有少量DRACH基序被修飾，因?yàn)橥怙@子連接復(fù)合體（EJC）會(huì)屏蔽DRACH基序的甲基化，從而將m?A導(dǎo)向長(zhǎng)的內(nèi)部外顯子和末端外顯子區(qū)域【1】。這導(dǎo)致m?A在mRNA上的分布不均勻，其豐度在終止密碼子附近顯著富集。然而，這種非隨機(jī)分布模式如何影響m?A的功能目前尚不清楚。

m?A的生物學(xué)效應(yīng)被認(rèn)為通過(guò)"閱讀器"蛋白以m?A依賴的方式結(jié)合mRNA來(lái)實(shí)現(xiàn)。盡管介導(dǎo)m?A依賴性mRNA降解的分子機(jī)制尚未完全解析，但已證實(shí)YTH結(jié)構(gòu)域家族蛋白（YTHDF1/2/3）參與這一過(guò)程。這些蛋白能招募CCR4-NOT去腺苷酸化酶復(fù)合體，該復(fù)合體被認(rèn)為是啟動(dòng)m?A mRNA降解的關(guān)鍵。最新研究還提出mRNA可能在YTHDF1與YTHDF2之間傳遞——前者促進(jìn)mRNA翻譯而后者促進(jìn)mRNA降解。但如何協(xié)調(diào)這些活性以防止mRNA在翻譯前被提前降解，仍需進(jìn)一步的研究。

近日，來(lái)自斯坦福大學(xué)的Lars M. Steinmetz和瑞士伯爾尼大學(xué)的Sebastian A. Leidel團(tuán)隊(duì)合作在Cell雜志上發(fā)表文章tRNA modifications tune m6A-dependent mRNA decay，發(fā)現(xiàn)m?A修飾在翻譯過(guò)程中可被tRNA識(shí)別。經(jīng)m6A修飾的密碼子會(huì)被核糖體低效解碼，使其成為"非最優(yōu)密碼子"，并導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄本上的核糖體碰撞現(xiàn)象，從而將mRNA翻譯過(guò)程與降解途徑偶聯(lián)。而tRNA反密碼環(huán)中的5-甲氧羰基甲基-2-硫尿苷（mcm5s2U）修飾能夠抵消這種效應(yīng)。這種mRNA與tRNA表觀轉(zhuǎn)錄組之間的關(guān)聯(lián)機(jī)制是首次被發(fā)現(xiàn)的。在癌癥中，m6A與mcm5s2U生物合成通路的失調(diào)（表現(xiàn)為mcm5s2U修飾增加）與腫瘤侵襲性增強(qiáng)及不良預(yù)后相關(guān)。

m6A位點(diǎn)的存在可加速多種mRNA的降解速率，但m6A位點(diǎn)在mRNA上的位置是否均等地影響這一過(guò)程尚不明確。為了探究位置效應(yīng)如何調(diào)控m6A介導(dǎo)的降解，研究人員采用miCLIP技術(shù)在HEK293T中繪制了m6A的單核苷酸分辨率全轉(zhuǎn)錄組圖譜，準(zhǔn)確定位每個(gè)m6A位點(diǎn)所屬的mRNA功能區(qū)。結(jié)果顯示，3'UTR區(qū)獨(dú)含m6A的mRNA不僅未加速降解，其穩(wěn)定性反而較無(wú)m6A的mRNA略有提升。與此形成鮮明對(duì)比的是，CDS區(qū)含有m6A的mRNA表現(xiàn)出顯著更高的降解速率。這一結(jié)論在小鼠胚胎干細(xì)胞中得到驗(yàn)證。對(duì)m6A在mRNA上的分布進(jìn)行量化分析，發(fā)現(xiàn)m6A在高度不穩(wěn)定mRNA的CDS區(qū)顯著富集，而穩(wěn)定mRNA的CDS區(qū)則基本不含m6A。m6A在終止密碼子周圍的特征性富集主要存在于總m6A水平低但高表達(dá)的穩(wěn)定mRNA中，即主要來(lái)源于這些CDS區(qū)缺乏m6A的穩(wěn)定mRNA。鑒于CDS區(qū)m6A可加速mRNA降解，那么是否這一過(guò)程與核糖體翻譯有關(guān)？研究人員使用翻譯抑制劑處理細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)顯著穩(wěn)定了CDS區(qū)含m6A的報(bào)告mRNA以及內(nèi)源性mRNA，證實(shí)其降解具有翻譯依賴性。整合分析翻譯抑制劑處理的HEK293T細(xì)胞的mRNA降解數(shù)據(jù)與m?A修飾組數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)mRNA的m?A修飾水平與其經(jīng)翻譯抑制劑處理后的穩(wěn)定化程度呈顯著正相關(guān)。在全轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)，10,564個(gè)基因中有4,120個(gè)（39%）表現(xiàn)出超過(guò)20%的穩(wěn)定化。mRNA的平均m?A水平與其翻譯依賴性降解程度存在顯著相關(guān)性。這些結(jié)果共同表明，轉(zhuǎn)錄組中大部分mRNA的m?A依賴性降解是由含m?A的CDS區(qū)翻譯過(guò)程介導(dǎo)的。

通過(guò)報(bào)告基因檢測(cè)與全轉(zhuǎn)錄組分析相結(jié)合，研究人員發(fā)現(xiàn)該效應(yīng)依賴于延伸中的核糖體對(duì)含m6A密碼子的翻譯，并以密碼子特異性方式發(fā)生。核糖體圖譜分析顯示，當(dāng)特定密碼子被m6A修飾時(shí)，其解碼效率顯著降低，表明m6A通過(guò)降低密碼子最優(yōu)性來(lái)標(biāo)記mRNA使其更易被降解。而tRNA反密碼子修飾——mcm?s2U可通過(guò)緩解m6A導(dǎo)致的密碼子最優(yōu)性下降，調(diào)控這一隱藏的遺傳密碼層。當(dāng)mcm?s2U缺失時(shí)，m6A修飾密碼子處的翻譯暫停現(xiàn)象更為顯著，且m6A修飾mRNA的降解加速。值得注意的是，m6A修飾會(huì)引發(fā)核糖體碰撞現(xiàn)象，這提示了一種不依賴于特定閱讀蛋白的m6A介導(dǎo)降解機(jī)制。

為了探究m?A與mcm?s2U的相互作用是否影響內(nèi)源mRNA的降解，研究人員在mcm?s2U缺陷細(xì)胞中抑制m?A修飾，其顯著上調(diào)CDS區(qū)m?A水平較高的mRNA，這一效應(yīng)在野生型細(xì)胞中顯著減弱。即mcm?s2U缺陷會(huì)增強(qiáng)m?A介導(dǎo)的mRNA降解。進(jìn)一步分析受影響mRNA的功能特征，結(jié)合對(duì)腫瘤特征基因集的分析，發(fā)現(xiàn)兩類重要功能基因在m?A依賴性降解上存在顯著差異：（1）具有管家功能的代謝通路基因，其mRNA通常穩(wěn)定且m?A修飾水平低；（2）信號(hào)通路組分編碼基因，其mRNA呈現(xiàn)高m?A修飾水平和快速降解特征。這些高修飾、不穩(wěn)定的信號(hào)通路mRNA在翻譯抑制劑處理的細(xì)胞中表現(xiàn)出優(yōu)先穩(wěn)定化現(xiàn)象，這表明m?A通過(guò)偶聯(lián)mRNA翻譯與快速降解來(lái)調(diào)控關(guān)鍵信號(hào)通路的表達(dá)。在mcm?s2U缺陷細(xì)胞中，這些信號(hào)通路的mRNA穩(wěn)定性進(jìn)一步降低。因此，mcm?s2U通過(guò)拮抗m?A效應(yīng)來(lái)穩(wěn)定重要信號(hào)通路mRNA，為這些精密調(diào)控的通路提供了持續(xù)表達(dá)的"許可"機(jī)制。研究人員進(jìn)一步探究mcm?s2U/m?A調(diào)控系統(tǒng)在人類癌癥中的作用。在正常人體組織中，mcm?s2U生物合成因子相對(duì)于m?A生物合成因子的表達(dá)水平與組織干性程度呈正相關(guān)。TCGA泛癌分析顯示腫瘤樣本中同樣存在向mcm?s2U修飾傾斜的趨勢(shì)。這些發(fā)現(xiàn)表明，干性增強(qiáng)和腫瘤發(fā)生與mcm?s2U/m?A許可系統(tǒng)的失衡密切相關(guān)。在一個(gè)乳腺癌患者隊(duì)列中發(fā)現(xiàn)，mcm?s2U/m?A許可系統(tǒng)的失衡與乳腺癌患者不良預(yù)后顯著相關(guān)。基于mcm?s2U/m?A許可系統(tǒng)構(gòu)建了一個(gè)全表觀轉(zhuǎn)錄組基因表達(dá)特征譜。該特征譜能對(duì)乳腺癌、肺癌、結(jié)直腸癌和血液系統(tǒng)腫瘤等不同癌種的患者進(jìn)行分層，且mcm?s2U修飾優(yōu)勢(shì)同樣主要與不良預(yù)后相關(guān)。這表明，mcm?s2U/m?A許可系統(tǒng)在多種人類癌癥中發(fā)揮重要作用，并可能作為一種泛癌生物標(biāo)志物。

總的來(lái)說(shuō)，研究發(fā)現(xiàn)了tRNA修飾與m?A通過(guò)功能互作共同調(diào)控mRNA降解，并揭示了全表觀轉(zhuǎn)錄組相互作用的新型基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制，對(duì)人類健康研究具有重要意義。

值得關(guān)注的是，來(lái)自康奈爾大學(xué)的Samie R. Jaffrey團(tuán)隊(duì)在Cell雜志上發(fā)表文章m6A alters ribosome dynamics to initiate mRNA degradation，揭示出m6A修飾會(huì)顯著改變核糖體動(dòng)力學(xué)，這些改變介導(dǎo)了m6A對(duì)mRNA的降解效應(yīng)。m6A是強(qiáng)有力的核糖體停滯誘導(dǎo)因子，此類停滯導(dǎo)致核糖體碰撞，形成不同于其他情境的特殊構(gòu)象。核糖體停滯程度與m6A介導(dǎo)的mRNA降解效率正相關(guān)，碰撞核糖體的持續(xù)存在會(huì)增強(qiáng)m6A依賴性降解。m6A位點(diǎn)的核糖體停滯與碰撞會(huì)招募YTHDF m6A閱讀器蛋白促進(jìn)mRNA降解。減少核糖體停滯與碰撞（如應(yīng)激狀態(tài)下的翻譯抑制）能穩(wěn)定m6A-mRNAs并提高其豐度，從而激活應(yīng)激反應(yīng)。這項(xiàng)研究首次揭示核糖體作為m6A的初始傳感器，通過(guò)感知m6A修飾啟動(dòng)mRNA降解程序。

研究人員首先觀察到m6A-mRNA的降解需要翻譯過(guò)程，加入翻譯抑制劑顯著增加高甲基化基因的表達(dá)水平，這就解釋了之前觀察到的“翻譯依賴性mRNA降解”現(xiàn)象。進(jìn)一步研究顯示，m6A促進(jìn)核糖體停滯，這種停滯非常顯著，以至于可能導(dǎo)致核糖體碰撞。m6A誘導(dǎo)的核糖體停滯受密碼子序列上下文的影響，并且m6A誘導(dǎo)停滯的能力與其誘導(dǎo)mRNA降解的能力相關(guān)。在m6A位點(diǎn)的停滯和隨后的碰撞可能促進(jìn)YTHDF的結(jié)合和mRNA降解機(jī)器的募集。這一通路在細(xì)胞應(yīng)激期間尤為重要，此時(shí)翻譯受到抑制，因此停滯和碰撞減少，導(dǎo)致m6A-mRNA的穩(wěn)定化。由此增加的m6A-mRNA有助于應(yīng)激的適應(yīng)性反應(yīng)。

m6A改變核糖體動(dòng)力學(xué)，從而起始mRNA降解，這一機(jī)制也需要更多的研究來(lái)完善其中的細(xì)節(jié)。例如，是停滯的核糖體還是隨后碰撞的核糖體導(dǎo)致m6A-mRNA降解，因?yàn)橥团鲎彩窍嚓P(guān)聯(lián)的。此外，YTHDF被募集到m6A位點(diǎn)的時(shí)間也難以確定。一種模型認(rèn)為，碰撞將YTHDF蛋白募集到碰撞界面；另一種可能是，碰撞的核糖體直接穩(wěn)定了YTHDF與A位點(diǎn)m6A的結(jié)合。m6A位點(diǎn)碰撞核糖體的獨(dú)特足跡可能是一個(gè)關(guān)鍵線索。然而，尚不清楚這種足跡是發(fā)生在YTHDF結(jié)合之前，還是YTHDF結(jié)合之后的結(jié)果。雖然YTHDF蛋白能與碰撞界面的核糖體蛋白和rRNA結(jié)合，但難以確定這些相互作用是否發(fā)生在生理性m6A誘導(dǎo)的雙核糖體形成過(guò)程中。使用在m6A位點(diǎn)碰撞的核糖體進(jìn)行冷凍電鏡研究，將為YTHDF蛋白與m6A及碰撞核糖體之間的精確相互作用提供更深入的見解。

總的來(lái)說(shuō)，研究揭示了核糖體是最初的m6A傳感器，核糖體在m6A處的停滯導(dǎo)致碰撞和YTHDF的募集。研究為理解m6A介導(dǎo)mRNA降解提供了新的視角。

https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(25)00415-5；

https://www.cell.com/cell/abstract/S0092-8674(25)00455-6

制版人： 十一

參考文獻(xiàn)

1.Uzonyi, A., Slobodin, B., and Schwartz, S. (2022). Exon-intron architecture determines mRNA stability by dictating m6A deposition. Preprint at bio- Rxiv.

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