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2025年5月28日，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所修建波教授，李毅教授以及許琪教授共通訊在Journal of Neuroinflammation發(fā)表：Endothelial TREM-1 mediates sepsis-induced blood brain barrier disruption and cognitive impairment via the PI3K/Akt pathway，揭示了內(nèi)皮細(xì)胞TREM-1通過(guò)PI3K/Akt通路介導(dǎo)膿毒癥引起的血腦屏障破壞和認(rèn)知功能障礙。

血腦屏障（BBB）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）與血液循環(huán)之間的一個(gè)關(guān)鍵選擇性屏障。血腦屏障功能障礙在膿毒癥引起的神經(jīng)系統(tǒng)損傷中起著重要作用。然而，膿毒癥期間血腦屏障破壞的機(jī)制仍不清楚。作者建立了一個(gè)由人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSC）衍生的血腦屏障模型，并發(fā)現(xiàn)用膿毒癥患者的血清處理會(huì)導(dǎo)致血腦屏障在結(jié)構(gòu)和功能上的破壞。在盲腸結(jié)扎穿刺（CLP）誘導(dǎo)的小鼠膿毒癥模型中，作者也觀察到了血腦屏障的破壞、大腦炎癥以及認(rèn)知功能的損傷。在這兩種模型中，作者都發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞中 TREM-1 的表達(dá)顯著增加。特異性敲除內(nèi)皮細(xì)胞中的 TREM-1 能夠緩解血腦屏障功能障礙和認(rèn)知損傷。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，TREM-1 影響與 PI3K/Akt 信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)。使用 PI3K 抑制劑后，TREM-1 抑制對(duì)血腦屏障和認(rèn)知功能的保護(hù)作用被消除。作者的研究結(jié)果表明，內(nèi)皮細(xì)胞中的 TREM-1 通過(guò) PI3K/Akt 信號(hào)通路引起膿毒癥導(dǎo)致的血腦屏障破壞和認(rèn)知功能障礙。靶向內(nèi)皮細(xì)胞 TREM-1 或 PI3K/Akt 信號(hào)通路可能是維持膿毒癥患者血腦屏障完整性并改善認(rèn)知功能的有前景的治療策略。

圖一 iPSC來(lái)源的血腦屏障模型的建立

為了探究膿毒癥對(duì)血腦屏障的影響，研究人員建立了基于人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的體外血腦屏障模型。血腦屏障的形成依賴(lài)于腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞之間的相互作用。研究人員首先制定了構(gòu)建該模型的實(shí)驗(yàn)方案，利用誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化出這三類(lèi)細(xì)胞并在Transwell系統(tǒng)中進(jìn)行培養(yǎng)。內(nèi)皮細(xì)胞被種植在膜上方，星形膠質(zhì)細(xì)胞和周細(xì)胞則位于膜的另一側(cè)。通過(guò)免疫熒光染色驗(yàn)證，iPSC成功分化為內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞，分別表達(dá)CD31、α-SMA和GFAP。跨內(nèi)皮電阻檢測(cè)顯示，僅由內(nèi)皮細(xì)胞形成的單層具有約550 Ω·cm2的電阻值，在與星形膠質(zhì)細(xì)胞或周細(xì)胞共培養(yǎng)后顯著升高，三者共同培養(yǎng)時(shí)達(dá)到近650 Ω·cm2，表明共培養(yǎng)條件下屏障完整性更好。與單獨(dú)培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞相比，共培養(yǎng)模型中4 kDa分子的通透性降低了約70%，而10 kDa和70 kDa葡聚糖的通透性也明顯下降，其中70 kDa分子的通透性降低達(dá)80%，說(shuō)明該模型具有更低的通透性。血腦屏障低通透性的關(guān)鍵在于內(nèi)皮細(xì)胞之間形成的緊密連接結(jié)構(gòu)，包括ZO-1和PECAM-1等蛋白。此外，GLUT-1和LRP-1等轉(zhuǎn)運(yùn)受體的表達(dá)也是血腦屏障功能的重要特征。免疫熒光染色結(jié)果顯示，這些關(guān)鍵蛋白在模型中均有良好表達(dá)。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與單獨(dú)培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞相比，在共培養(yǎng)模型中，ZO-1、PECAM-1、LRP-1和GLUT-1等基因的表達(dá)水平顯著上調(diào)。Western blot結(jié)果也驗(yàn)證了這些蛋白表達(dá)的增加，進(jìn)一步證明共培養(yǎng)條件促進(jìn)了血腦屏障相關(guān)功能的成熟。

圖二 CLP手術(shù)誘導(dǎo)的膿毒癥會(huì)導(dǎo)致BBB破壞和認(rèn)知障礙

已有研究表明，在膿毒癥動(dòng)物模型中會(huì)出現(xiàn)腦部炎癥且在CLP模型中血腦屏障功能受損。本研究進(jìn)一步證實(shí)，在接受CLP手術(shù)的成年雄性C57BL/6J野生型小鼠中也出現(xiàn)了腦部炎癥和血腦屏障破壞。實(shí)驗(yàn)采用CLP方法誘導(dǎo)小鼠發(fā)生膿毒癥。對(duì)照組小鼠狀態(tài)良好，存活率為100%，而膿毒癥模型組小鼠術(shù)后出現(xiàn)死亡，最終存活率為60%。與對(duì)照組小鼠體重相對(duì)穩(wěn)定相比，存活的CLP手術(shù)小鼠表現(xiàn)出明顯的體重下降。此外，還觀察到腹瀉、膿尿、眼睛閉合或眼部分泌物、活動(dòng)減少等現(xiàn)象。為了評(píng)估小鼠的行為表現(xiàn)，作者使用神經(jīng)行為評(píng)分系統(tǒng)對(duì)角膜反射、翻正反射、耳廓反射、尾閃實(shí)驗(yàn)和逃避反射等功能進(jìn)行了評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示，在觀察期內(nèi)，CLP組小鼠整體表現(xiàn)較差，術(shù)后前三天其神經(jīng)行為評(píng)分顯著低于對(duì)照組。術(shù)后一天即可觀察到血腦屏障完整性的喪失，表現(xiàn)為伊文思藍(lán)滲漏實(shí)驗(yàn)結(jié)果異常升高。考慮到膿毒癥會(huì)引發(fā)全身性炎癥反應(yīng)并影響大腦，作者進(jìn)一步檢測(cè)了腦組織中的炎癥水平。結(jié)果顯示，在膿毒癥發(fā)生24小時(shí)后，CLP組小鼠海馬組織中的IL-1β和IL-6水平明顯高于對(duì)照組。這些結(jié)果共同表明，CLP引起的系統(tǒng)性炎癥導(dǎo)致了包括代謝紊亂、肝損傷和腎功能衰竭在內(nèi)的多器官功能障礙。由于膿毒癥可能伴隨認(rèn)知功能障礙，作者在CLP手術(shù)一周后對(duì)小鼠進(jìn)行了行為測(cè)試以評(píng)估其認(rèn)知能力。新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)顯示，CLP組小鼠對(duì)新物體的探索次數(shù)更少，識(shí)別指數(shù)顯著低于對(duì)照組。在Morris水迷宮測(cè)試中，CLP組小鼠找到平臺(tái)所需的時(shí)間更長(zhǎng)，游泳路徑更遠(yuǎn)，到達(dá)平臺(tái)的時(shí)間明顯延長(zhǎng)，停留在目標(biāo)象限的時(shí)間更短，穿越該區(qū)域的次數(shù)也更少，說(shuō)明膿毒癥引發(fā)了空間記憶功能障礙。此外，作者在CLP術(shù)后24小時(shí)和10天分別從小鼠中分離出腦內(nèi)皮細(xì)胞并進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，CLP術(shù)后1天的小鼠腦內(nèi)皮細(xì)胞中有369個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，156個(gè)基因表達(dá)下調(diào)，通路富集分析提示這些差異表達(dá)基因可能參與多個(gè)相關(guān)通路。術(shù)后10天時(shí)，有102個(gè)基因上調(diào)，26個(gè)基因下調(diào)。通過(guò)比較第1天和第10天的轉(zhuǎn)錄譜，作者篩選出了61個(gè)在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)表達(dá)一致的基因。進(jìn)一步的KEGG通路分析揭示了這些一致性表達(dá)基因所富集的多個(gè)潛在信號(hào)通路。

圖三 在內(nèi)皮細(xì)胞中敲除 TREM-1 可減輕 CLP 小鼠模型的認(rèn)知障礙

AAV-BI30能夠在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)高效且特異于內(nèi)皮細(xì)胞的Cre介導(dǎo)的基因調(diào)控。作者構(gòu)建的重組腺相關(guān)病毒（rAAV）能夠靶向腦內(nèi)皮細(xì)胞。通過(guò)尾靜脈注射后一個(gè)月，與對(duì)照組小鼠相比，注射了TREM-1 sgRNA的小鼠其腦內(nèi)皮細(xì)胞中不再表達(dá)TREM-1。隨后，這些小鼠接受了CLP手術(shù)，并通過(guò)體重評(píng)估、神經(jīng)行為評(píng)分、新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)和Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)等方法評(píng)估TREM-1敲除對(duì)CLP小鼠腦內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用。各組小鼠死亡數(shù)量被記錄下來(lái)，假手術(shù)組小鼠狀態(tài)良好，存活率為100%。在CLP模型組中，注射TREM-1 sgRNA的小鼠存活率為63.6%，高于對(duì)照組小鼠的55%。在體重評(píng)估中，與假手術(shù)組相比，CLP手術(shù)顯著降低了小鼠體重。神經(jīng)行為評(píng)分結(jié)果顯示，假手術(shù)組小鼠在術(shù)后第一天略有下降后迅速恢復(fù)至基線水平；而在CLP組中，評(píng)分在術(shù)后第一天下降，并在一周后緩慢恢復(fù)。其中，TREM-1敲除小鼠的神經(jīng)行為評(píng)分在一周時(shí)恢復(fù)得更快。在CLP術(shù)后一天進(jìn)行伊文思藍(lán)滲漏實(shí)驗(yàn)評(píng)估血腦屏障通透性，結(jié)果表明TREM-1敲除減輕了CLP引起的血腦屏障損傷。為進(jìn)一步驗(yàn)證TREM-1敲除是否能緩解膿毒癥相關(guān)的認(rèn)知障礙，作者在CLP術(shù)后第6天開(kāi)始進(jìn)行行為測(cè)試。在新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)中，TREM-1敲除小鼠對(duì)新物體的探索頻率更高，識(shí)別指數(shù)明顯高于對(duì)照組。在Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中，記錄了小鼠的運(yùn)動(dòng)軌跡、找到平臺(tái)所需時(shí)間、在目標(biāo)象限停留時(shí)間和穿越次數(shù)。結(jié)果顯示，盡管在最后一天找到平臺(tái)的時(shí)間沒(méi)有明顯差異，但在訓(xùn)練初期，TREM-1敲除小鼠比對(duì)照組更快找到平臺(tái)。此外，TREM-1敲除小鼠在目標(biāo)象限停留時(shí)間更長(zhǎng)，穿越次數(shù)更多，表明其空間記憶能力有所改善。綜上所述，TREM-1在內(nèi)皮細(xì)胞中的敲除可以減輕膿毒癥導(dǎo)致的血腦屏障破壞和大腦功能損傷。抑制TREM-1可能成為治療膿毒癥的新策略。

綜上所述，內(nèi)皮細(xì)胞中的TREM-1在膿毒癥中介導(dǎo)了血腦屏障的破壞和認(rèn)知功能障礙。抑制TREM-1可通過(guò)PI3K/Akt通路減輕血腦屏障損傷和認(rèn)知功能紊亂。因此，TREM-1的抑制可作為治療膿毒癥的一種潛在策略。

文章來(lái)源

https://doi.org/10.1186/s12974-025-03469-5