冠狀病毒（ CoV ） 擁有 當前已知RNA病毒中 最大最復雜的基因組 ， 可以 通過獨特的校對機制維持其 巨大 基因組的保真 性 。這一機制依賴非結構蛋白nsp14的外切核酸酶（ ExoN ）結構域 。 ExoN 可切除 在新生RNA鏈3 ’ 末端摻入的錯配核苷酸，從而降低復制過程中出現錯誤的概率。 作為 一類重要的抗病毒小分子 化合物 ， 核苷酸類似物可以被RNA聚合酶識別并摻入新生RNA鏈中，從而終止RNA延伸或提高基因組的突變率。目前，FD A批準的三種治療新冠病毒的小分子藥物中有兩種都是核苷類似物 ，包括 瑞德西韋和莫努匹韋。然而，冠狀病毒的 校正機制 可能 會 將摻入RNA 鏈 中的 核苷酸類似物 切除， 從而 使得本可發揮作用的 抗病毒 核苷類似物“功虧一簣” 。因此，解析 ExoN 識別并切除 核苷酸類似物 的分子機制 ，對于 設計能逃逸 冠狀病毒 校對 機制 的 核苷酸類似物 具有重要意義。

近日，清華大學基礎醫學院、 教育部蛋白質科學重點實驗室婁智勇教授 團隊 及香港理工大學劉冬生教授團隊在 Journal of the American Chemical Society 發表了題為Structural basis and rational design of nucleotide analogue inhibitor evading the SARS-CoV-2 proofreading enzyme的研究論文，該研究評估了冠狀病毒nsp10/14復合體對不同核苷酸類似物的切割效率，并利用冷凍電鏡解析了新冠病毒nsp10/14:RNA-SMP復合體及nsp10/14:RNA-ATMP復合體結構。此外，該研究提出了冠狀病毒ExoN識別核苷酸類似物的分子模型及ExoN對核苷酸類似物切割活性的評估策略，為開發可以逃逸ExoN的核苷酸類似物提供了支持。

研究人員 首先利用化學合成將多種核苷酸類似物 分別 摻入RNA的3 ’ 末端，然后評估了新冠病毒nsp10/14復合體對 不同 RNA底物的 水解效率。結果顯示nsp10/14對3 ’ 末端摻入索菲布韋單磷酸（SMP）的RNA水解效率顯著低于其他RNA底物。值得注意的是，盡管AT-527和SMP在核糖上具有相同的 2 ’ -F/Me 修飾，然而其抵御 ExoN 水解的能力差異明顯。 為了闡明其潛在的原因 ，研究 人員 分別 解析了nsp10/14 :RNA-SMP 及 nsp10/14:RNA-ATMP 復合體 的 結構 。 結果顯示 ，相比于天然核苷酸，SMP 核糖上的2 ’ -F/Me削弱了其與nsp10/14 之間 的 相互作用，這導致SMP無法穩定結合在 ExoN 的活性中心 。 反之，在nsp10/14:RNA-ATMP復合體中， ExoN 與ATMP的鳥嘌呤堿基之間的相互作用大大彌補了這些相互作用的缺失，使得ATMP 可以 穩定結合在活性中心， 并 更容易受到催化水的親核攻擊。 通常， ExoN 的活性中心可以招募一個水分子，并在 “DEDDH“催化殘基 及二價金屬離子的作用下穩定在磷酸二酯鍵附近，用來親核攻擊磷酸二酯鍵從而造成斷鍵。然而，在nsp10/14:RNA-SMP復合體中， 研究人員沒有在nsp10/14:RNA-SMP復合體的 ExoN 催化中心觀察到催化水的密度，說明 水分子無法 穩定結合在催化中心來破壞SMP上的磷酸二酯鍵。這也與前面酶活動力學檢測觀察到的結果相一致。 值得注意的是， 研究人員 在nsp10/14:RNA-ATMP復合體 的 ExoN 活性口袋 中 觀察到了三個水分子的密度，并根據其功能不同，將其分別定義為輔助水（a-H 2 O）、橋接水（b-H 2 O）和催化水（c-H 2 O）。這三個水分子在介導 ExoN 對ATMP的水解中發揮十分關鍵的作用。

通過結構比較，研究人員發現H 95 、Q145和F146與核苷酸類似物之間的相互作用可能影響 ExoN 的水解效率。因此， 研究人員分別將H 95 、Q145和F146突變為丙氨酸，并檢測了nsp10/14突變體對RNA-ATMP底物的反應效率。結果顯示，相比于野生型蛋白，nsp10/14突變體對底物的反應效率均顯著下降。為了排除核糖修飾可能對 蛋白 酶活帶來的影響， 研究人員還評估了nsp10/14突變體對 天然 RNA底物的水解效率，其結果 與RNA-ATMP底物一致。

隨后，研究人員 將結構生物學與分子動力學模擬相結合， 開發了一種基于結構的 活性 評估系統 。 這種方法通過 計算在正確位置檢測催化水存在的概率 ，來評價nsp14 ExoN 對摻入RNA鏈的核苷酸類似物的水解活性。根據突變實驗和結構分析，研究人員確定E92為 磷酸二酯鍵裂解過程中 用于 穩定催化水的主要 氨基酸 殘基。 當催化 水位于目標磷酸鹽原子和 E92的羧基附近，同時與目標磷酸鹽及其鄰近核苷酸的O3'對齊，則被 認為 可以進行 親核攻擊。 研究人員對不同系統分別進行了 100 ns的 分子動力學 模擬， 并選取了 最后50 ns的軌跡用于分析。結果表明，催化水存在的概率在不同的系統中是不同的，其中 在 nsp10/14: RNA-SMP系統 中存在 的概率明顯低于其他系統。這一觀察結果與生化結果一致，即RNA-SMP底物抵抗 ExoN 水解 的能力明顯高于 其他底物。 此外，研究人員還 改變了催化水的檢測 閾值，并發現 在不同 閾值 下， 不同 系統中催化水 存在 的可能性保持一致， 說明該方法具有一定 的 穩定 性。 綜合以上結果，研究人員提出了冠狀病毒nsp14 ExoN 反應的“拉-切“模型： 當 RNA鏈3 ’ 端 的核苷酸類似物 到達nsp14 ExoN 的活性位點時，如果它們的堿基部分與H95/Q145/F146形成充分的相互作用， 則會 導致核苷酸 類似物呈現”舒展“的 構象，這有利于 催化水攻擊磷酸二酯鍵 。在這種情況下，核糖 上 2 ’ -F/Me修飾不會影響nsp14 ExoN 募集水分子進行 親核攻擊 。相反，如果 核苷酸類似物 的堿基部分不能與H95/Q145/F146形成充分的相互作用， 則會使 核苷酸 類似物 處于“ 蜷縮 ”的構象。在 這種 構象中，2 ’- F/Me修飾可能阻止了 ExoN 對 催化 水 的募集，從而減弱了nsp14 ExoN 的 水解效率。

在此基礎上， 研究人員 提出 ， 能夠 逃逸 nsp14 ExoN 水解 的 核苷酸類似物必須具有 ：(1)一個不與H95/Q145/F146相互作用的堿基；(2)核糖上有適當的化學修飾（如2 ’ -F/Me）。基于這一原理， 研究人員設計了兩種可能逃逸nsp14 ExoN 水解的核苷酸類似物。這兩種核苷酸類似物保留了核糖上2 ’ -F/Me修飾，僅對堿基部分進行改造。其中compound 1 采用了腺嘌呤堿基，compound 2采用了脫氧尿嘧啶堿基。通過分子動力學模擬和酶活動力學檢測，研究人員發現這兩種核苷酸類似物均可以有效抵御nsp14 ExoN 水解，且效果比SMP更佳。值得注意的是，這兩種核苷酸類似物還可以終止RNA聚合酶的延伸反應，說明其具有抑制冠狀病毒 在細胞內增殖 的潛力。

總的來說，這項研究通過將酶活動力學檢測、結構生物學與分子動力學模擬相結合，解析了冠狀病毒 ExoN 識別并切除核苷酸類似物的機制，并提出了設計可能逃逸 ExoN 水解的核苷酸類似物的基本原理。此外，該研究還 建立了一種全新的評估系統，即 通過計算催化水在正確位置出現的概率 來預測 ExoN 對核苷酸類似物的水解能力，為在未來應對 冠狀病毒帶來的挑戰提供了必要的工具。

清華 大學 婁智勇 教授 和 香港理工大學劉冬生 教授 為本文的共同通訊作者， 清華大學 博士研究生 王俊博 、 潘玙璠和劉奕 瀟 為本文的共同第一作者。

原文鏈接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.5c05014

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