藍(lán)莓（Vaccinium spp.）為杜鵑花科越橘屬植物，是一種具有良好保健作用的水果。‘藍(lán)美一號’（Vaccinium corymbosum ‘Lanmei 1’）是目前國內(nèi)引進(jìn)育種選育出的藍(lán)莓國家級林木良種，具有產(chǎn)量高、易種植、果實花色苷含量高等優(yōu)點(diǎn)。藍(lán)莓富含多糖、維生素、酚酸和類黃酮，以及多種微量元素等，具有極高的營養(yǎng)價值。

沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院的喬艷艷、李冬男*、李斌*等 以檸檬酸溶液提取藍(lán)莓多糖，通過DEAE-52纖維素離子交換和葡聚糖凝膠柱層析從粗多糖中純化出多糖BPN1，通過高效尺寸排阻色譜與多角度激光散射-示差檢測（HPSEC-MALLS-RI）系統(tǒng)分析BPN1的分子質(zhì)量，通過1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）衍生的高效液相色譜（HPLC）法分析BPN1單糖組成，通過傅里葉變換紅外光譜（FTIR）、甲基化及氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）聯(lián)用以及一維和二維核磁共振波譜（NMR）解析BPN1的糖苷鍵連接、構(gòu)型以及結(jié)構(gòu)特征，進(jìn)一步研究BPN1的抗氧化和體外抗菌活性，以期為藍(lán)莓多糖的結(jié)構(gòu)研究提供基礎(chǔ)，也為藍(lán)莓多糖的開發(fā)與應(yīng)用提供理論依據(jù)。

01

多糖提取和純化

經(jīng)檸檬酸輔助提取、透析后得到藍(lán)莓粗多糖，將藍(lán)莓粗多糖通過活性炭脫色、Sevag試劑脫蛋白，檢測脫色、脫蛋白前后粗多糖的總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為47.05%（相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）：2.45%）和57.74%（RSD：2.19%），蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為4.35%（RSD：9.00%）和2.27%（RSD：5.63%），糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為75.58%（RSD：1.78%）和84.38%（RSD：2.09%），經(jīng)DEAE-52分級分離，以純水洗脫得到多糖組分BPN，計算BPN相對于脫色除蛋白后粗多糖的得率為7.52%。將BPN通過Sephadex G-100進(jìn)一步純化后，BPN1得率為4.70%。

02

分子質(zhì)量和均一性分析

BPN1的HPSEC-MALLS-RI色譜圖見圖1A。BPN1除RI檢測為對稱單一峰外，激光散射（LS）檢測到另外兩個峰，其在RI檢測器中未檢測出，表明其含量極低。經(jīng)HPSEC-MALLS-RI檢測BPN1的分子質(zhì)量分布結(jié)果見表1。BPN1的重均分子質(zhì)量mw為2.991×104 Da。多分散系數(shù)（mw/mn）越接近1，表示分子質(zhì)量分布范圍越小，分子質(zhì)量越集中。BPN1的多分散系數(shù)為1.163，表明BPN1的分子質(zhì)量分布范圍較窄。

03

單糖組成分析

BPN1經(jīng)水解、PMP衍生后的HPLC色譜圖見圖1B，通過比較單糖標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖，分析BPN1的單糖組成，可知BPN1主要由Glc（30.65%，相對含量，下同）、Gal（17.19%）、Xyl（18.76%）和Ara（32.55%）組成，另含有微量Man（0.42%）、GlcN（0.27%）、Rha（0.13%）和GlcA（0.04%）。

04

FTIR分析

FTIR分析表明BPN1顯示典型的多糖紅外譜圖，見圖1C。其特征吸收峰包括3 440.87、2 926.45、1 635.34 cm-1以及1 039.44 cm-1附近的特征吸收。其中，3 440.87 cm-1和2 926.45 cm-1分別歸屬于O—H伸縮振動和C—H不對稱伸縮振動。1 635.34 cm-1處的峰對應(yīng)于羰基的伸縮振動。在1 000 cm-1到1 200 cm-1范圍內(nèi)的吸收峰表明BPN1可能存在C—O—C鍵、C—O—H拉伸振動、C—C和環(huán)振動，如BPN1在1 039.44 cm-1處出現(xiàn)的吸收峰。紅外光譜僅初步判斷部分結(jié)構(gòu)特征，需要結(jié)合甲基化及GC-MS分析和核磁解析對BPN1進(jìn)行進(jìn)一步結(jié)構(gòu)解析。

05

甲基化及GC-MS分析

BPN1的總離子流圖見圖2，根據(jù)每個色譜峰的相對保留時間和質(zhì)譜圖，對比文獻(xiàn)數(shù)據(jù)和美國佐治亞大學(xué)復(fù)雜碳水化合物研究中心數(shù)據(jù)庫（https://glygen.ccrc.uga.edu/ccrc/specdb/ms/pmaa/pframe.html）的離子碎片質(zhì)譜圖，分析每個色譜峰對應(yīng)的糖殘基類型，利用峰面積計算其含量，結(jié)果見表2。其中相對響應(yīng)值＝峰面積/分子質(zhì)量；物質(zhì)的量分?jǐn)?shù)/%＝相對響應(yīng)值/各組分相對響應(yīng)值總和×100。

06

核磁分析

通過一維核磁1H-NMR、13C-NMR、DEPT-135和二維核磁相關(guān)譜（COSY）、異核單量子相關(guān)譜（HSQC）、異核多鍵相關(guān)譜（HMBC）、核Overhauser效應(yīng)譜（NOESY）檢測，獲取BPN1主要糖殘基的H和C化學(xué)位移信息，推斷各個糖殘基之間的連接順序，BPN1的核磁譜圖見圖3。

采用一維1H-NMR進(jìn)一步鑒定BPN1的糖苷鍵構(gòu)型。多糖的氫譜信號大多數(shù)在δ 3.0～5.5，通常δ 4.5～5.5之間為異頭質(zhì)子（H1）共振區(qū)。多糖的異頭碳（C1）信號的化學(xué)位移一般在δ 90～110之間，其中，α構(gòu)型異頭碳信號通常出現(xiàn)在δ 95～103之間，β構(gòu)型異頭碳信號通常在δ 101以上，C2～C5的信號集中區(qū)位于δ 65～85區(qū)域，取代位置碳會出現(xiàn)苷化位移，將向低場移動，δ 60附近為未被取代的C6信號，而被取代的C6信號則往低場移至δ 69附近。BPN1的1H-NMR譜圖上大量質(zhì)子共振信號集中在δ 3.0～5.5區(qū)域，信號重疊嚴(yán)重。綜合1H-NMR譜圖、13C-NMR譜圖、COSY圖譜和HSQC譜圖分析，BPN1有多個異頭區(qū)信號峰，這些異頭區(qū)域信號化學(xué)位移分別為δ 5.15/109.15、δ 5.07/106.93、δ 5.10/106.93、δ 5.03/107.41、δ 5.00/107.30、δ 5.08/98.37、δ 5.00/101.26、δ 4.87/98.55、δ 4.87/98.54、δ 4.55/104.26、δ 4.46/104.26、δ 4.46/102.58、δ 4.45/102.55。異頭信號歸屬后，通過COSY、HSQC、HMBC和NOESY，結(jié)合1H-NMR、13C-NMR、DEPT-135譜圖以及單糖組成和甲基化分析結(jié)果，對照相關(guān)文獻(xiàn)相似糖殘基取代的化學(xué)位移數(shù)據(jù)，上述糖殘基依次標(biāo)記為A、A’、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L，將BPN1中主要類型糖殘基的1H和13C化學(xué)位移信號進(jìn)行歸屬，結(jié)果見表3。

通過HMBC遠(yuǎn)程相關(guān)譜上異頭氫與各個糖殘基上碳的偶合信號，或異頭碳與各個糖殘基上氫的偶合信號，以及相鄰糖殘基連接位點(diǎn)上的兩個質(zhì)子由于空間位置靠近而容易產(chǎn)生較強(qiáng)的NOE信號，利用HMBC遠(yuǎn)程相關(guān)譜和NOESY譜可進(jìn)一步地推斷出各個糖殘基之間的相互連接順序。如HMBC圖譜中糖殘基C的H1（δ 5.03）與糖殘基D的C5（δ 66.45）有相關(guān)信號峰（C H1/D C5），說明糖殘基→3,5)-α-L-Araf-(1→與→5)-α-L-Araf-(1→存在連接，連接位點(diǎn)位于C5位；糖殘基C的H1（δ 5.03）與糖殘基C的C5（δ 66.16）有相關(guān)信號峰（C H1/C C5），說明糖殘基→3,5)-α-L-Araf-(1→與→3,5)-α-L-Araf-(1→存在連接，連接位點(diǎn)位于C5位；糖殘基D的H1（δ 5.00）與糖殘基K的C6（δ 66.34）有相關(guān)信號峰（D H1/K C6），說明糖殘基→5)-α-L-Araf-(1→與→4,6)-β-D-Glcp-(1→存在連接，連接位點(diǎn)位于C6位；糖殘基D的H1（δ 5.00）與糖殘基D的C5（δ 66.45）有相關(guān)信號峰（D H1/D C5），說明糖殘基→5)-α-L-Araf-(1→存在自身連接，連接位點(diǎn)位于C5位等。NOESY圖譜中糖殘基C的H1（δ 5.03）與糖殘基D的H5（δ 3.72）有相關(guān)信號峰（C H1/D H5），說明糖殘基→3,5)-α-L-Araf-(1→與→5)-α-L-Araf-(1→存在連接，連接位點(diǎn)位于C5位；糖殘基A的H1（δ 5.15）與糖殘基C的H5（δ 3.75）有相關(guān)信號峰（A H1/C H5），說明糖殘基α-L-Araf-(1→與→3,5)-α-L-Araf-(1→存在連接，連接位點(diǎn)位于C5位；糖殘基E的H1（δ 5.08）與糖殘基K的H6（δ 3.80）有相關(guān)信號峰（E H1/K H6），說明糖殘基→2)-α-D-Xylp-(1→與→4,6)-β-D-Glcp-(1→存在連接，連接位點(diǎn)位于C6位；糖殘基B的H1（δ 5.10）與糖殘基B的H3（δ 3.89）有相關(guān)信號峰（B H1/B H3），說明糖殘基→3)-α-L-Araf-(1→存在自身連接，連接位點(diǎn)位于C3位，如此依次解析。綜合單糖組成、甲基化分析結(jié)果以及一維和二維核磁信息分析及參考文獻(xiàn)，推測BPN1的結(jié)構(gòu)為1→4連接的葡聚糖主鏈，部分葡萄糖6位取代有阿拉伯聚糖、Xyl、半乳寡聚糖等側(cè)鏈，具體見圖4。

07

抗氧化活性

生命代謝過程會產(chǎn)生各種自由基，自由基的積累會使得機(jī)體產(chǎn)生氧化損傷而引起衰老、腫瘤等相關(guān)慢性疾病。DPPH自由基是一種較穩(wěn)定的自由基，被廣泛用于評價各種抗氧化劑清除自由基的能力。實驗測定了BPN1在0.1～1 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)對DPPH自由基的清除能力，結(jié)果見圖5。BPN1對DPPH自由基的清除能力均呈濃度依賴性增大，在0.1、0.5 mg/mL和1.0 mg/mL質(zhì)量濃度條件下，對DPPH自由基的清除率分別為13.11%、28.82%和46.45%。作為對比，金桂勇等采用熱水浸提法提取藍(lán)莓果渣粗多糖，經(jīng)分離純化后得到的4 個多糖組分在1 mg/mL質(zhì)量濃度條件下對DPPH自由基的清除率均低于30%，杜佳等優(yōu)化了藍(lán)莓多糖的熱水浸提工藝，同樣發(fā)現(xiàn)熱水浸提藍(lán)莓多糖在1 mg/mL質(zhì)量濃度下對DPPH自由基的清除率均低于30%，提示檸檬酸輔助提取的藍(lán)莓多糖抗氧化能力更強(qiáng)。

羥自由基被認(rèn)為是活性氧中最有害的自由基，其通過芬頓反應(yīng)產(chǎn)生，它可以很容易地穿過細(xì)胞膜，并容易與細(xì)胞內(nèi)的生物分子發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致組織損傷或細(xì)胞死亡，因此，清除羥自由基對抗氧化防御至關(guān)重要。進(jìn)一步檢測了BPN1對羥自由基的清除能力，結(jié)果見圖5。在0.1、0.5 mg/mL和1.0 mg/mL質(zhì)量濃度條件下，BPN1對羥自由基的清除率分別為26.73%、48.16%和78.88%。

ABTS也是一種常用的自由基清除活性測定試劑，其操作簡單、快速，已被用于測定多糖的總抗氧化能力。ABTS在氧化劑的作用下可被氧化為綠色的ABTS陽離子自由基，在734 nm或405 nm波長條件下有強(qiáng)吸收，在抗氧化劑的作用下ABTS陽離子自由基被抑制，吸光度降低，可據(jù)此檢測樣品的抗氧化能力。檢測了BPN1對ABTS陽離子自由基的清除能力，結(jié)果見圖5。在0.1、0.5 mg/mL和1.0 mg/mL質(zhì)量濃度條件下，BPN1對ABTS陽離子自由基的清除率分別為14.85%、30.66%和49.86%。而前人研究報道，熱水浸提的藍(lán)莓多糖在1 mg/mL質(zhì)量濃度條件下對ABTS陽離子自由基的清除率均低于25%，可能原因在于實驗選用藍(lán)莓不同，或由于熱水浸提藍(lán)莓多糖與本實驗BPN1的單糖組成及分子質(zhì)量有較大差異，相比于金桂勇報道的BBP-0主要由Glc、Ara和Gla組成，本實驗結(jié)果表明BPN1中Xyl也有較大占比。此外，本實驗中BPN1的水溶性較差，且高濃度BPN1水溶液存在一定顏色干擾，所以未能檢測和比較在質(zhì)量濃度大于1 mg/mL后BPN1對自由基的清除能力。

08

抗菌活性

由于細(xì)菌對許多商用抗生素產(chǎn)生耐藥性，越來越多研究致力于尋找新的具有抑菌活性的天然產(chǎn)物，天然多糖等的抗菌活性也有較廣泛報道。本實驗考察了BPN1對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的MIC和MBC。首先將不同質(zhì)量濃度BPN1分別與金黃色葡萄球菌和大腸桿菌混合培養(yǎng)，其生長曲線見圖6A。BPN1對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的MIC均介于2.5～5 mg/mL之間。將所有經(jīng)過不同質(zhì)量濃度BPN1處理的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌轉(zhuǎn)移到固體培養(yǎng)基上，觀察細(xì)菌的存活情況。如圖6B所示，所有已經(jīng)被抑制生長的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均未出現(xiàn)菌落生長，說明BPN1在抑制大腸桿菌生長的同時就已經(jīng)殺死大腸桿菌，BPN1對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的MIC即為MBC。

細(xì)菌形態(tài)的變化是評估抗菌劑對細(xì)菌的影響的重要指標(biāo)之一。通過掃描電子顯微鏡觀察金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的形態(tài)，驗證BPN1對細(xì)菌細(xì)胞膜的破壞情況，結(jié)果見圖7A。對照組細(xì)菌呈現(xiàn)表面完整的細(xì)菌形態(tài)，經(jīng)BPN1處理后，金黃色葡萄球菌和大腸桿菌表面出現(xiàn)了褶皺（黃色箭頭），部分細(xì)菌的形態(tài)被破壞。細(xì)菌染色技術(shù)可對細(xì)菌狀態(tài)和生理功能進(jìn)行評估。通過STYO 9和PI對BPN1處理的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌染色，分析細(xì)菌的活力和細(xì)胞膜完整性，結(jié)果見圖7B、C。未經(jīng)BPN1處理的對照組細(xì)菌顯示大量綠色熒光，無明顯紅色熒光出現(xiàn)，而經(jīng)BPN1處理后，細(xì)菌顯示不同程度的紅色熒光，說明BPN1對細(xì)菌膜有一定程度破壞。有研究報道多糖可通過破壞細(xì)菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，增加細(xì)胞通透性，導(dǎo)致細(xì)菌結(jié)構(gòu)損傷，從而發(fā)揮抑菌活性。本研究結(jié)果也表明，BPN1能夠一定程度上破壞金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的細(xì)胞膜，發(fā)揮抗菌活性。

09

結(jié)論

本研究采用檸檬酸輔助提取法提取藍(lán)莓粗多糖，將粗多糖通過活性炭脫色、Sevag試劑脫蛋白后，采用DEAE-52離子交換柱層析和Sephadex G-100葡聚糖凝膠柱層析從藍(lán)莓中純化得到中性多糖BPN1。通過HPSECMALLS-RI分析BPN1的mw為2.991×104 Da，均一性良好。PMP衍生及高效液相色譜檢測結(jié)果表明BPN1主要由Glc、Gla、Xyl和Ara組成。通過紅外分析、甲基化和GC-MS分析BPN1的糖苷鍵構(gòu)型和連接方式，結(jié)合一維及二維核磁譜圖解析，推測BPN1的主鏈結(jié)構(gòu)為1→4連接的葡聚糖，部分葡萄糖6位取代有阿拉伯聚糖、Xyl、半乳寡聚糖等側(cè)鏈。自由基清除實驗表明BPN1有較好的DPPH自由基、ABTS陽離子自由基和羥自由基清除能力，結(jié)合文獻(xiàn)調(diào)研發(fā)現(xiàn)，酸輔助提取藍(lán)莓多糖BPN1比熱水提取藍(lán)莓多糖抗氧化能力更強(qiáng)，可能原因為不同提取方法造成的分子質(zhì)量及單糖組成差異。體外抑菌實驗表明BPN1對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的MIC均介于2.5～5 mg/mL之間，且能夠破壞金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的細(xì)胞膜，發(fā)揮抗菌活性。本研究系統(tǒng)解析了藍(lán)莓多糖的結(jié)構(gòu)，探究了藍(lán)莓多糖的抗氧化和抗菌活性，將為藍(lán)莓多糖的進(jìn)一步結(jié)構(gòu)解析及活性開發(fā)利用提供研究基礎(chǔ)。

本文《藍(lán)莓多糖的結(jié)構(gòu)解析、抗氧化及抗菌活性》來源于《食品科學(xué)》2024年45卷第21期94-103頁，作者：喬艷艷，蔣洪洲，李冬男*，李 斌*。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20231209-079。點(diǎn)擊下方閱 讀原文即可查看文章相關(guān)信息。

實習(xí)編輯：梁雯菁；責(zé)任編輯：張睿梅。點(diǎn)擊下方閱讀原文即可查看全文。圖片來源于文章原文及攝圖網(wǎng)

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