空間轉錄組（spatial transcriptome）調控細胞中大分子在 時空 上的定位，對RNA代謝 ， 局部翻譯（local translation） ，以及細胞生理功能 具有重要影響。自1983年首次發現海鞘胚胎中不對稱的肌動蛋白mRNA亞細胞定位，各種生物系統中都陸續發現了獨特的RNA空間定位模式。空間轉錄組的生物學意義在大型、不對稱細胞（如神經元）中尤為重要。通過在正確的時間和位置放置特定的RNA，神經元有效地彌合了從納米級分子到比其大六到九個數量級的細胞之間的巨大尺度差異。隨著研究的深入，異常的RNA定位也被發現與越來越多的疾病相關，尤其是神經系統疾病，如肌萎縮側索硬化癥（ALS）、脆性X綜合征（FXS）和脊髓型肌萎縮癥（SMA）等。

高通量成像（如MERFISH）和測序方法（如APEX-seq）揭示了數千種RNA在不同生物體系中的特定空間定位。然而，此前學術界對于空間轉錄組的功能探索 非常有限， 僅限于少數RNA 。其 主要原因是目前人們使用的技術難以在細胞，尤其是原代細胞（如神經元）中操縱內源RNA的空間定位。傳統的 操縱 RNA空間定位的方法通常需要使用MS2重復序列標記RNA，并通過MS2衣殼蛋白（MCP）調控RNA在細胞中的空間定位來實現功能研究。但該方法需要對內源基因進行編輯，因此難以進行高通量操控，而且該方法在原代細胞中的應用存在挑戰。

2025年5月21日，斯坦福大學的亓磊實驗室在Nature雜志 在線 發表了題為

Programmable control of spatial transcriptome in live cells and neurons

CRISPR-TO利用II類VI型CRISPR-Cas13系統進行空間轉錄組的調控。II類VI型CRISPR-Cas13系統是一種在RNA引導下靶向RNA的核糖核酸酶（RNA-guided, RNA-targeting ribonuclease）。通過突變Cas13的核糖核酸酶結構域可以獲得其失活變體dCas13 (dead Cas13)。dCas13能夠高效且特異性地結合目標RNA，而不會導致其降解。利用這一可編程性，作者開發了CRISPR-TO，將dCas13與介導亞細胞定位的信號肽段/蛋白或馬達蛋白（motor protein）通過化學誘導的異二聚化機制（heterodimerization）相結合，通過兩種模式—被動擴散與停靠（passive diffusion and docking），以及主動運輸（active transport）—實現了可誘導、可逆的靶向RNA定位。

CRISPR-TO技術的核心優勢在于其能夠在不改變基因序列的前提下，輕松實現對內源RNA分子亞細胞定位的精準時空調控。 利用CRISPR-TO，作者成功實現了對內源RNA（包括mRNA和noncoding RNA）在不同細胞類型中多種亞細胞區室的空間靶向定位調控，包括線粒體外膜，P-小體（p-body），應激顆粒（stress granule），端粒，核應激小體（nuclear stress body），以及由馬達蛋白介導的沿微管進行的雙向主動RNA運輸。而通過將CRISPR-TO與活細胞RNA成像技術相結合，作者實現了對活細胞中RNA定位動態的實時操控和觀測。在研究過程中，作者發現將mRNA靶向定位到P-小體顯著降低了mRNA的降解常數，并延長了mRNA的半衰期。這些結果為尚存爭議的P-小體功能提供了關鍵實驗證據，支持了“P-小體的主要功能是mRNA存儲位點而非降解場所”的理論。

除了 腫瘤細 胞系，作者還在體外培養的原代小鼠皮層神經元（primary mouse cortical neuron）中利用CRISPR-TO成功實現了內源mRNA在活細胞中的超長距離（約1 mm）運輸。此外，該系統還可以通過共表達多個向導RNA（gRNA）輕松實現對多個mRNA的共同運輸和定位調控，以研究其協同作用，而這種協同調控利用以往任何一種方法都很難實現。作者通過超分辨成像技術成功觀測到了被CRISPR-TO運輸的內源β-肌動蛋白mRNA（ACTB mRNA）與核糖體共同運輸，并在神經突和神經突末端進行局部翻譯。有趣的是，將內源β-肌動蛋白mRNA定位到神經突末端 迅速 增強了動態絲狀偽足突起（filopodial protrusion）的形成，同時抑制了損傷后軸突的再生。

該項研究的另一突破在于，CRISPR-TO技術的可編程性使其能夠進行高通量篩選（high-throughput screening），從而使空間轉錄組功能的系統性研究成為可能。 作者進行了基于CRISPR-TO的陣列化篩選，以評估21種 內源 mRNA在原代小鼠皮層神經元的神經突中的定位對神經突生長的影響。通過自動化高內涵顯微成像（high-content automated microscopy）對神經突生長進行追蹤，作者發現將 Stmn2 mRNA運輸定位到神經突可以驅動神經突的快速生長。 Stmn2 mRNA編碼微管結合蛋白Stathmin-2，參與微管動力學和突觸再生，并且和肌萎縮側索硬化（ALS）的病理過程有關。此前通過微陣列分析觀察到 Stmn2 mRNA的軸突定位，但其功能意義仍不清楚。本文作者通過RNA熒光原位雜交（RNA FISH）和不同條件下對神經突生長實驗的重復，成功驗證了CRISPR-TO介導的 Stmn2 mRNA在神經突中的富集，并驗證了上述亞定位變化對神經突生長的促進，為治療肌萎縮側索硬化癥提供了新的研究思路。

通過對空間轉錄組進行精準、可逆和大規模的時空調控，CRISPR-TO彌合了現有測序和成像技術留下的關鍵空白，提供了一個高通量研究空間轉錄組功能的平臺，未來將極大地促進不同生物學系統和疾病背景下對空間轉錄組的功能研究。

本文通訊作者為斯坦福大學生物工程系的亓磊教授。亓磊教授是CRISPR領域的先驅，從天然CRISPR-Cas9核酸酶中開發出了 首 個核酸酶失活型dCas9。亓磊教授實驗室開發了一系列CRISPR工具，包括用于基因表達調控的CRISPRi和CRISPRa ，表觀遺傳學精準調控， 用于DNA和RNA實時成像的LiveFISH和Oligo-LiveFISH ，微型CRISPR分子，以及大規模轉錄組調控的工具MEGA-Cas13等 工具，極大地豐富了CRISPR工具箱，并將CRISPR的應用擴展至基因編輯以外的領域。這些CRISPR工具在科研和轉化醫學領域已經得到廣泛應用 ，包括基于CRISPR的表觀遺傳學調控工具已經進入臨床轉化治療肌肉萎縮癥。

圖注：a-b, CRISPR-TO在細胞系（a）和神經元（b）中的工作原理示意圖。c, 利用CRISPR-TO在原代小鼠皮層神經元（白色）中實現對內源β-肌動蛋白mRNA（紅色）沿神經突的超長距離運輸。

第一作者韓夢婷博士本科和博士畢業于北京大學化學與分子工程學院，博士階段導師為陳興教授，現為斯坦福大學生物工程系博士后。

https://www.nature.com/articles/s41586-025-09020-z

韓夢婷博士將于2025年8月以助理教授身份入職美國印第安納大學布盧明頓分校（Indiana University Bloomington）生物系并開設實驗室。實驗室將致力于開發新型化學生物學、合成生物學和CRISPR技術來研究不同生物學體系中空間轉錄組的調控機制、生物學功能及其在疾病發展中的作用，并從空間轉錄組的角度出發，深入探索神經退行性疾病的新型治療策略。 實驗室長期歡迎對相關研究方向感興趣的研究生和博士后加入，期待與您共同探索生命科學的奧秘 。

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