摘要：本文介紹了一種從大腸桿菌中簡單、快速且廉價地生產和分離功能性單克隆抗體及抗體片段的方法。傳統的抗體生產依賴于哺乳動物細胞，成本高、耗時長。而新方法利用囊泡成核肽（VNp）標簽技術，只需基礎微生物培養和分子生物學設備，就能在大腸桿菌中實現抗體生產，為全球科研和診斷治療領域提供了新途徑。

一、研究背景：抗體生產的現狀與挑戰

抗體（或免疫球蛋白）在疾病診斷、治療及科研中是重要試劑，存在多種形式，其結構和功能雖有差異，但在重組表達時面臨共同難題，如精確折疊、鏈間和鏈內二硫鍵形成以及糖基化等翻譯后修飾，以確保在體內的穩定性和功能。

目前，生物治療用單克隆抗體的生產主要依賴哺乳動物表達系統，如中國倉鼠卵巢（CHO）細胞，這類系統有助于抗體的正確折疊和復雜的翻譯后修飾。相比之下，一些簡單的抗原結合片段（Fab）等可在大腸桿菌中表達，大腸桿菌生長更簡單快速，在發酵培養中產量較高，但通常需特殊處理來形成正確的二硫鍵，以獲得功能性抗體復合物。

二、材料與方法：構建高效生產體系

（一）細胞培養

大腸桿菌培養：使用 LB 和 TB 培養基，添加卡那霉素。將新鮮轉化的大腸桿菌在 LB 培養基中培養至飽和，再接種到 TB 培養基中，在 30°C、200 轉 / 分鐘條件下過夜培養，通過增大液體表面積增強氧氣供應。當培養物的 OD600 達到 0.8 - 1.0 時，添加 IPTG 誘導重組蛋白表達。

裂殖酵母培養：原養型裂殖酵母 cam1.gfp 細胞在含谷氨酸氮源的愛丁堡基本培養基（EMMG）中，25°C 培養，維持在對數生長早期至中期 48 小時后進行甲醛固定。

人細胞培養：A2780 人卵巢癌細胞和 RPE - 1 人細胞系在含 10% 胎牛血清的 Iscove 改良杜氏培養基（IMDM）中，37°C、5% CO?條件下培養。用于后續固定和顯微鏡分析的細胞，以每 35mm 培養皿 5×10?個細胞的密度鋪板，培養 24 小時后固定。

（二）蛋白處理與純化

可溶性蛋白提取：大腸桿菌細胞沉淀用 Tris 緩沖液重懸后超聲破碎，離心去除細胞碎片；人細胞沉淀用裂解緩沖液重懸，冰上孵育后離心去除細胞碎片。

蛋白純化：Fab 和 mAb 異二聚體可通過鎳親和純化和蛋白 G 親和純化，或直接用蛋白 G 進行一步純化。將含抗體的細菌細胞提取物過濾后與蛋白 G 基質結合，經多次洗滌后用甘氨酸洗脫抗體，并中和。通過凝膠密度測定和光譜法確定純化功能性 IgG 復合物的產量。

（三）免疫分析與檢測

采用Western blot、免疫沉淀、免疫熒光等免疫分析方法，以及酶聯免疫吸附測定（ELISA）檢測抗體的功能和特異性。使用顯微鏡對樣品進行可視化觀察，包括 Olympus IX71 顯微鏡和 Leica TCS SP8 STED 3× 顯微鏡 。在分子生物學方面，對標簽和基因序列進行大腸桿菌表達的密碼子優化，并提供了相關表達質粒信息。

三、研究結果：新技術的成功驗證

（一）Fab 異二聚體的生產

通過構建質粒，使大腸桿菌共表達抗溶菌酶單克隆抗體 D1.3 的 Fab 重鏈和輕鏈的 VNp 融合蛋白，并連接雙分子熒光互補（BiFC）編碼序列。結果顯示，在大腸桿菌中表達后，胞質囊泡結構出現 BiFC - Venus 熒光（圖 1C），與 VNp 依賴的膜結合囊泡外觀一致（圖 1D） 。經分析證實成功生產并純化出正確折疊的 Fab 異二聚體，且該 Fab 復合物能與溶菌酶結合，確認了其功能（圖 1F）。

（二）mAb 的生產

構建針對 Muc1 的 mAb 的 VNp 融合基因，在大腸桿菌中表達后，VNp - mAb 鏈可作為可溶性蛋白共純化。Western blot 和免疫熒光分析證實了純化的 mAb 復合物的異二聚體性質和功能（圖 2D、圖 2E） 。此外，用同樣方法成功生產了抗 GFP 和抗 6xHis 的 mAb，ELISA 和 Western blot 等分析確認了其功能，且從 1 升大腸桿菌搖瓶培養物中可獲得毫克級產量（圖 3B - 圖 3E）。

四、討論：新技術的優勢與意義

本研究應用VNp 標簽技術，實現了從細菌細胞中簡單快速地表達和純化多種功能性 IgG 復合物。該方法產量高，從每升大腸桿菌過夜搖瓶培養物中可分離出毫克級的親和純化功能性 mAb，且純化后的 mAb 在 Western blot 分析中稀釋至亞納摩爾濃度仍可檢測。整個過程僅需 3 天，從細菌轉化到純化出活性抗體，相比以往方法無需優化表達水平、靶向周質、蛋白復溶或化學誘導二硫鍵形成等步驟。

雖然細菌產生的 mAbs 缺乏哺乳動物蛋白的糖基化，但研究表明糖基化和非糖基化 IgGs 在體外結合和體內血液中的壽命相當。與哺乳動物細胞培養系統相比，該細菌抗體生產方法成本更低，細菌生長更快、更簡單，不需要專業的組織培養設施，且一步純化策略無需昂貴的色譜純化設備和試劑，使單克隆抗體生產對僅具備基礎分子和微生物學設施的研究實驗室成為可能，將單克隆抗體生產方法推廣到了全球研究社區。

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