腦聲小店基于深度科研洞察，專注為動物實驗提供"簡器械·精實驗"解決方案。我們突破高精設(shè)備局限，開發(fā)手工定制化儀器及配件，通過科研巧思將基礎(chǔ)工具轉(zhuǎn)化為創(chuàng)新實驗方案。產(chǎn)品涵蓋行為學(xué)裝置、操作輔助工具等，使實驗室在保持操作簡效的同時，實現(xiàn)精細(xì)化數(shù)據(jù)采集，助力科研人員以創(chuàng)造性思維發(fā)掘簡易儀器的潛在科研價值。

行為學(xué)箱本體規(guī)格為38cmｘ18cmｘ20cm的長方體空間，箱壁由4塊厚度為4mm的亞克力板構(gòu)成，除一塊長箱壁為透明以外均為黑色。箱底由21根直徑2mm的鋁合金棒并排而成，兩根鋁合金棒之間留有足夠空間以防止小鼠糞便堆積。透明箱壁外10cm處放置一塊17英寸LCD顯示器，平均亮度40cd／m2，刷新率60Hz。行為學(xué)箱架高以保證箱底和屏幕下邊緣處于同一高度。箱內(nèi)由兩塊9cmｘ2mmｘ18cm的黑色亞克力板隔為三室。中央為起始室（起始室），左右為選擇室（選擇室）。在每室中央位置的透明壁上距箱底2.5cm高處均開有直徑2cm的圓孔，兩個選擇室的圓孔中各固定一根用于供水的鼠用灌胃針，起始室的圓孔用以使小鼠將鼻尖伸入來觸發(fā)單次實驗，圓孔上方箱壁設(shè)置有LED作為引導(dǎo)小鼠觸發(fā)的線索。每個圓孔兩側(cè)裝有紅外LED激光對射開關(guān)用來識別小鼠在每次實驗中的起始觸發(fā)和獎賞獲取觸發(fā)行為。每組開關(guān)由一個發(fā)射器（白色）和接收器（黑色）組成，并于相連接的電線一起用3D打印樹脂模具固定于透明箱壁內(nèi)側(cè)。紅外LED光路與箱壁圓孔圓心高度齊平。在紅外LED光路未受阻擋時，接收器一端輸出高電平，反之輸出低電平。該設(shè)備通過左右兩塊電路板控制兩個微型蠕動泵（直流電驅(qū)動，額定電壓24V），當(dāng)小鼠觸發(fā)任務(wù)獎賞時，I/O設(shè)備輸出高電平到電路板，電路板輸出24V電壓驅(qū)動蠕動泵經(jīng)硅膠軟管向左右選擇室之一供水。

行為學(xué)箱結(jié)構(gòu)示意簡圖

小鼠簡化愛荷華博弈決策實驗

飲水限制階段：

由于本實驗向小鼠提供的獎賞是飲水，因此行為學(xué)訓(xùn)練開始前48小時，移除小鼠飲水，使小鼠在實驗開始前進(jìn)入干渴狀態(tài)，為小鼠完成實驗提供動力。實驗過程中，飲水原則上只能通過任務(wù)獎賞獲得。在實驗期間，小鼠食物供給維持正常。每天，均進(jìn)行小鼠體重的測量記錄，以監(jiān)控其健康情況。實驗中的飲水獎賞控制在（全部完成的情況下）1 ml／天左右，此水量能基本維持小鼠體重恒定。若小鼠體重在實驗過程中下降到飲水限制前的80％以下，將給予小鼠適量的補(bǔ)充飲水。

自由探索（free drinking）階段：

飲水限制48小時后，小鼠將被置于行為學(xué)箱中進(jìn)行自由探索。行為學(xué)箱經(jīng)由基于Matlab的腳本設(shè)置為不需小鼠在起始室觸發(fā)。飲水獎賞于左右選擇室嚴(yán)格交替供給。行為學(xué)箱前的屏幕始終為灰屏。此階段的目的在于使小鼠了解在兩側(cè)選擇室可以通過靠近灌胃針獲得飲水，并促使小鼠保持在行為學(xué)箱內(nèi)的活動，同時盡量避免小鼠形成對其中一側(cè)選擇室的偏好。該階段實驗每天進(jìn)行1組（session），每組包含100次實驗（trial）。大多數(shù)小鼠可以在2-3天內(nèi)達(dá)到30分鐘內(nèi)完成1組的目標(biāo)。3天后，自由探索階段結(jié)束。

觸發(fā)-單側(cè)飲水（center to left／center to right）階段：

在小鼠學(xué)會從兩側(cè)選擇室獲取飲水之后，將行為學(xué)箱驅(qū)動腳本設(shè)置為需要小鼠于起始室觸發(fā)每次實驗，并從其中一側(cè)選擇室獲取飲水獎賞。能夠獲取飲水獎賞的選擇室每天之內(nèi)保持固定，且與前一天相反（按照左-右-左-右的順序）。行為學(xué)箱前的屏幕始終為灰屏。起始室的LED將在小鼠觸發(fā)實驗后熄滅，獲取飲水獎賞后亮起。此階段，當(dāng)日無飲水獎賞的選擇室將被一塊黑色亞克力板完全隔斷，小鼠將只能在其他兩個室內(nèi)活動。對于每次實驗，觸發(fā)后設(shè)置有20秒的應(yīng)答時間。若在此時間內(nèi)小鼠未前往選擇室獲取獎賞，該次實驗記為超時（miss），不計入總實驗數(shù)，并對小鼠播放0.5秒的8000Hz白噪音作為懲罰。此階段的目的在于使小鼠學(xué)會在起始室中觸發(fā)單次實驗之后再前往選擇室獲取飲水獎賞，通過隔斷一側(cè)選擇室以降低學(xué)習(xí)難度，每天更換隔斷側(cè)以盡量避免小鼠在此階段形成對其中一側(cè)選擇室的偏好。本階段每天進(jìn)行1組，每組包含100次有效實驗。正常小鼠一般能夠在4-6天（center to left和center to right各2-3次）之內(nèi)達(dá)到30分鐘內(nèi)完成1組的目標(biāo)。若小鼠在6天后未能完成此階段目標(biāo)，將被剔除出本實驗。

偏好檢測階段：

在小鼠學(xué)會從起始室觸發(fā)單次實驗之后，去除行為學(xué)箱中的隔板，并將行為學(xué)箱驅(qū)動腳本設(shè)置為小鼠可以在每次實驗觸發(fā)之后完全自由地選擇一側(cè)選擇室獲取飲水獎勵。每個選擇室的獎賞幾率均為100％，單次給水量為10？l。行為學(xué)箱前的屏幕將在小鼠觸發(fā)實驗和獲取飲水獎賞時，于屏幕底邊中央展示不同黑色圖案，以便于實驗者隨后通過行為學(xué)錄像對小鼠的行為進(jìn)行手動標(biāo)記。所展示圖案面積較小，以避免擾亂小鼠進(jìn)行任務(wù)。起始室的LED將在小鼠觸發(fā)實驗后熄滅，獲取飲水獎賞后亮起。每次實驗的應(yīng)答時間縮短為15秒，超時后本次實驗作廢，并對小鼠播放白噪音作為懲罰。每次實驗后，程序?qū)⒆詣佑嬎悴⒂涗浶∈髮蓚?cè)選擇室的偏好指數(shù)（preference index＝ttotal／tright，tright為小鼠選擇右側(cè)選擇室的實驗數(shù)，ttotal為總實驗數(shù)）。本階段每天進(jìn)行1組，每組包含100次有效實驗，并在小鼠的偏好指數(shù)連續(xù)3天保持相對穩(wěn)定后結(jié)束，一般需要5天左右。

IGT階段：

獲取小鼠對左右選擇室的起始偏好之后，通過行為學(xué)箱驅(qū)動腳本，將小鼠偏好的一側(cè)選擇室（定義為博弈室，gambling chamber）獎賞幾率設(shè)置為0．1，給水量設(shè)置為30?l，另一側(cè)選擇室（定義為安全室，safe chamber）獎賞幾率設(shè)置為0．8，給水量10?l。行為學(xué)箱前的屏幕將在屏幕底邊中央即時顯示小面積黑色圖案以區(qū)別小鼠觸發(fā)實驗，觸發(fā)獎賞以及觸發(fā)后無獎賞（空獎賞）三種情境。起始室的LED將在小鼠觸發(fā)實驗后熄滅，獲取飲水獎賞后亮起。每個實驗的應(yīng)答時間上限為10秒，超時后當(dāng)次實驗不計入總實驗數(shù)，并播放白噪聲作為懲罰。本階段每天進(jìn)行10組，每組包含10次有效實驗。程序?qū)⒆詣佑嬎悴⒂涗泦谓M內(nèi)小鼠對博弈室及安全室的偏好指數(shù)。小鼠一般能夠在5~7天之內(nèi)學(xué)會使獲飲水獎賞量期望最高的策略，即將飲水選擇局限在安全室。7天后，IGT階段結(jié)束。

反轉(zhuǎn)（reversal）IGT階段：

對于部分在IGT階段表現(xiàn)優(yōu)秀的小鼠，額外增加反轉(zhuǎn)IGT階段，即將IGT階段博弈室和安全室的設(shè)置顛倒過來，并在之后每一到兩天再顛倒一次，迫使小鼠需要經(jīng)常重新計算飲水獎賞獲取的期望，形成新的任務(wù)策略，以確定小鼠的確是通過對獎賞期望的估計來調(diào)整自己的決策行為的。本階段的其他設(shè)置均和IGT階段相同，大約持續(xù)2周。

本實驗過程中，每只小鼠始終保持在同一個行為學(xué)箱當(dāng)中完成任務(wù)。在實驗當(dāng)中，經(jīng)常進(jìn)行行為學(xué)箱的清潔，以避免遺留的糞便、尿液或氣味對小鼠完成任務(wù)造成影響。

注射250nl的AAV9-CamKII-GCamP6f-mCheiry至mPFC注射位點（A／P：＋1.9mm，m／L：＋0.3mm，D／V：-1.7mm），注射速度為20nl／min。注射完成后等待5~10分鐘以使病毒溶液充分?jǐn)U散，確定無漏液后，退出注射針，縫合頭皮，切斷麻醉氣體，將小鼠置于恒溫環(huán)境下的鼠籠中，并保持對小鼠恢復(fù)情況的觀察。手術(shù)后，大約等待2-3周以使GCamP6病毒廣泛表達(dá)，即可進(jìn)行鈣信號采集。

鈣信號采集

采集鈣信號之前，首先將微型顯微鏡的CMOS芯片通過配套數(shù)據(jù)傳輸線連接到數(shù)據(jù)采集控制器上。在微型顯微鏡物鏡端螺紋上纏繞適量生料帶，以增強(qiáng)微型顯微鏡與固定基座之間的連接緊密程度，并保護(hù)螺紋不受磨損。在數(shù)據(jù)傳輸線上的適當(dāng)位置用足夠長的線固定一個氦氣球，以減輕顯微鏡對小鼠頭部的壓力。取下小鼠頭上微型顯微鏡固定基座的保護(hù)蓋，小心地將微型顯微鏡旋入固定基座，同時通過數(shù)據(jù)采集控制器配套軟件打開顯微鏡上的LED，開啟視頻流傳輸以監(jiān)控視野中的熒光信號，直到將微型顯微鏡旋至最佳成像位置后，記錄該位置，旋緊固定基座上的螺絲，并采集少量幀數(shù)的熒光圖像作為后續(xù)記錄時的參照。將小鼠小心放入行為學(xué)箱起始室，待小鼠適應(yīng)并開始進(jìn)行任務(wù)后，開始采集鈣信號。鈣信號采樣率為10Hz，所采集的直接數(shù)據(jù)為分辨率400ｘ400 pixels的16 bit灰度．tif格式圖片。每釆集6分鐘左右（約3600幀）需要暫停采集，以存儲之前所采集的數(shù)據(jù)。每只小鼠每次采集大約需要1-2小時。

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行為學(xué)數(shù)據(jù)處理

小鼠簡化IGT實驗中，通過基于Matlab環(huán)境的行為學(xué)箱驅(qū)動腳本同步記錄各次實驗編號，相對時間，小鼠觸發(fā)后應(yīng)答時間（response time），小鼠對選擇室的選擇以及偏好，小鼠累計獲取飲水量等。對于每只小鼠，作者使用偏好檢測階段的最后三天偏好指數(shù)的平均值作為小鼠對兩側(cè)選擇室的起始偏好指數(shù)。偏好指數(shù)取值范圍在［0，1］，0代表完全偏好于博弈室，1代表完全偏好于安全室。在IGT階段，將小鼠在該階段完成的所有完整實驗組看作連續(xù)過程，未完成的實驗組將被舍棄。在對同組小鼠的行為學(xué)數(shù)據(jù)，如偏好指數(shù)和應(yīng)答時間進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析時，所有小鼠的數(shù)據(jù)統(tǒng)一以實驗完成最快（實驗組數(shù)最少）的小鼠的實驗組數(shù)為基準(zhǔn)納入統(tǒng)計。

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