腦聲小店基于深度科研洞察，專注為動物實驗提供"簡器械·精實驗"解決方案。我們突破高精設備局限，開發手工定制化儀器及配件，通過科研巧思將基礎工具轉化為創新實驗方案。產品涵蓋行為學裝置、操作輔助工具等，使實驗室在保持操作簡效的同時，實現精細化數據采集，助力科研人員以創造性思維發掘簡易儀器的潛在科研價值。

癲癇發作可以表現為感覺異常、認知障礙、肢體部分或者全身抽搐、強直、陣攣發作、肌陣攣發作等；在電生理學方面，腦電圖（electroencephalogram，EEG）為棘波、棘慢復合波、尖波等癲癇樣波形，波形特點為突然發作的節律性、高振幅和高頻尖峰，持續約20s后突然終止。海人藻酸（kainic acid，KA）亦名紅藻氨酸、海藻氨酸，是一種從天然海藻中提取的離子型谷氨酸受體的激動劑，具有很強的興奮和致癇作用，作用于突觸后膜非甲基-D-天冬氨酸受體（N-methylD-aspartic acid receptor，NMDA），并產生興奮性突觸后電位，導致癲癇發作。在小鼠腦內單側海馬注射KA能誘發自發性反復性的癲癇發作，并產生了與人類顳葉癲癇患者相似的認知功能損傷，這為研究顳葉癲癇機制或新型抗癲癇藥物（antiepileptic drugs，AEDs）提供了良好且有效的動物模型。

動物模型對于理解癲癇的復雜生物學機制和推動新抗癲癇藥物的研發至關重要。多篇文獻報道成功建立了抗藥性癲癇動物模型，包括貓、狗和斑馬魚等。然而，嚙齒類動物，尤其是大小鼠，在作為癲癇研究的模型上顯示出更多的適宜性。電刺激誘發法是構建顳葉癲癇模型的經典方法，以其高度可靠的誘發癲癇發作而聞名，但此方法的復雜性使其在選擇時受到限制。隨著光遺傳學和化學遺傳學技術的發展，癲癇模型的構建和控制達到了新的精確度。另一方面，化學誘導的動物模型，盡管控制精度相對較低，仍因其簡便性、低成本以及能夠較真實地模擬疾病的某些特征，在特定研究中維持其必要性。以KA誘導的模型為例，它能精確復現海馬硬化的經典組織病理學特征，主要影響海馬邊緣結構，使其成為研究中常用且潛在的難治性顳葉癲癇動物模型。

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KA誘發慢性癲癇模型

（1）麻醉：腹腔內注射（i.p.）40mg/kg三溴乙醇將小鼠麻醉，1~5min后小鼠完全失去知覺，然后可以開始進行實驗操作。（2）固定：在成功麻醉后，首先剪掉小鼠頭部的毛發，然后將其固定在立體定位儀上，用前端門齒鉗夾住小鼠門齒，插入雙側耳桿固定小鼠，并調整雙側耳桿的位置。使小鼠位于臺面正中央，并將門齒與雙側耳桿調整于同一個平面。固定過程中觀察小鼠的呼吸和心跳是否正常，固定結束后檢查頭部是否晃動，固定牢固以便于鉆孔及注射藥物，如圖1A。（3）備皮、暴露頭骨：使用碘伏對小鼠暴露的頭皮進行消毒，隨后使用彎剪沿著小鼠頭部的矢狀線剪開頭皮，暴露出頭皮旁邊約2cm的皮膚。接著，使用3%H2O2消去骨膜，暴露頭骨。（4）吸取KA：先用微量注射泵吸取500nL的KA（0.5μg/μL，生理鹽水溶解），并將微量注射泵固定于立體定位儀上。（5）定位：把微量注射泵針尖對準前囟點，將前囟作為坐標原點，將FranklinPaxinos小鼠腦圖譜（2001）作為參考，在海馬腹側CA3區（AP：-3.1mm；ML：-2.7mm；DV：-3.0mm）做標記。（6）開顱：將微量注射泵移開，用顱鉆在標記處鉆孔，操作時調整力度，不要損傷顱骨下腦組織，以免引起出血。（7）顱內注射：重新調整微量注射泵的位置：先移至前囟點，再次調整到標記點的位置，讓微量注射泵針尖對準并貼近鉆孔，以300nL/min的速度緩慢進針，深度為3.0mm（DV：-3.0mm）。根據前期預實驗注射染料驗證，這個深度正好對應海馬CA3區。注射后留針5min，以防止KA倒流，然后再緩慢拔出注射泵。對照組小鼠操作與上述相似，在海馬CA3區同一位置注射生理鹽水即可。（8）關顱：檢查是否有活動性出血，如果沒有出血，就縫合小鼠頭部的皮膚。縫合部位可以用碘伏進行消毒。（9）將小鼠放置在溫度為37℃的加熱板上，讓其緩慢恢復。

小鼠立體定位手術及顱內注射過程

（1）定制電極：電極下端有雙股電極絲，末端去除絕緣層，雙極不等長，相差0.5mm，電極下端還有一根銀絲。（2）記錄電極的放置：在用三溴乙醇麻醉小鼠并將其固定在立體定位儀后，暴露頭骨，按照KA注射的方法，在同一位置即右側海馬CA3區（AP：-3.1mm；ML：-2.7mm；DV：-3.0mm）進行電極安裝。等電極深至海馬3.0mm后，再用膠水固定。（3）參考電極的放置：在小鼠小腦顱骨上方鉆一個小孔，然后輕輕將螺絲釘旋入孔口，確保螺絲釘底部不接觸腦組織。將電極的銀絲繞在螺絲釘上，作為參考電極。（4）固定電極：完成電極安裝后，將牙科水泥粉末和液體混合均勻，涂抹在電極上，大約等待10min讓水泥固定。（5）術后：待電極固定后，將小鼠放置在溫度為37℃的加熱板上，讓其緩慢恢復。一旦小鼠恢復正常，可以讓其獨立飼養，自由攝取食物和水，1周后進行腦電信號采集。

腦電記錄

腦電采集：埋置電極1周后可以開始采集腦電，利用電線將小鼠電極與腦電采集設備相連，每天采集10h腦電并統計發作次數和發作時間，如圖2。腦電圖用1~50Hz帶通濾波器進行過濾。腦電信號采集結束后，由兩名有經驗的腦電圖醫師或技師對腦電圖進行分析和判定。定義腦電圖波形突然升高，并伴有肢體陣攣或強直-陣攣性發作的行為為一次癲癇發作。詳細記錄小鼠每次癲癇發作的時間和過程。

小鼠腦電設備及其連接

行為學觀察

通過腦電和視頻記錄進行回顧，觀察小鼠行為。癲癇發作的確認需要在分析腦電的同時觀察視頻里小鼠的行為，腦電信號與小鼠行為相匹配即可進行統計癲癇發作次數和癲癇腦電信號分析。癲癇發作程度由Racine分級標準判斷。根據Racine行為等級分類，小鼠的癲癇發作標準如下：I級：凝視、行為呆滯、面部抽搐；II級：咀嚼、節律性點頭等；III級：陣攣性發作、前肢單側抬起；IV級：陣攣性發作、雙側前肢抬起、后肢站立、肢體強直；V級：雙側前肢陣攣性發作、失去平衡后跌倒；VI級：強直性抽搐、癲癇持續狀態（status epilepticus，SE）或死亡。通常，將I到III級發作視為局灶性發作（focal seizure，FS），將IV和VI級發作視為全身性大發作（generalized seizure，GS）。

KA注射后2周、電極植入后1周，小鼠進入慢性發作期，該時期小鼠出現反復性、自發性的癲癇發作，這是慢性期的主要特點。以3只較為理想的小鼠模型為例，其發作次數表現為叢集性，總結發作次數為表1。將3只小鼠不同時間段癲癇發作次數與對照組進行比較，在21~27d和35~41d具有顯著性差異，但是在14~20和28~34d并無顯著性差異。這與腦電檢測到的慢性期小鼠的癲癇發作特點相符合，其并非均勻分布，發作次數及時間并無規律，反而會出現無規律聚集，即某一時間段頻繁發作或不發作。當小鼠發作時，表現為以咀嚼、呆滯、雙側前肢痙攣等為特點的局灶性發作，短時間內發展為肢體強直、SE、跌倒等全身性大發作，持續時間約20~50s，隨后自行緩解，發作頻率不等。

腦電采集設備記錄的EEG數據使用1~50Hz的帶通濾波器進行過濾，癲癇發作的確認需要在分析腦電的同時觀察視頻里小鼠的行為，腦電信號與小鼠行為相匹配即可進行統計癲癇發作次數和癲癇腦電信號分析。根據需要分析視頻信息以確認與癲癇發作相關的行為。對照組小鼠無癲癇發作，腦電圖以5~12Hz活動為主，波幅為20~50μV。KA組小鼠在慢性發作期的腦電圖特點為：突發的高振幅、節律性棘波或棘慢波，持續時間約20~50s，并突然終止。SE小鼠EEG表現為持續性、節律性的棘波、棘慢波或尖波，持續約40~50s，隨即進入約10s的發作后抑制，并且幾乎無放電發生。慢性癲癇小鼠在癲癇發作間期會出現波幅高于正常值的棘波放電，這種情況可能是由于少數神經元異常同步放電所致。

參考文獻：

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• 葉祖亮,苗育靜,劉全磊,等.海人藻酸建立內側顳葉癲癇小鼠模型的研究[J/OL].中國實驗動物學報:1-9[2024-04-16].