腦血管病是一類以腦部血管病變為基礎，導致腦組織發生缺血性或出血性損傷的疾病，具有高發病率、高致殘率和高死亡率等特點。在全球范圍內，腦血管病已成為導致死亡和長期殘疾的主要原因之一，給患者及其家庭帶來沉重負擔。在中國，腦血管病的發病率和患病率呈逐年上升趨勢，已成為公共衛生領域亟待解決的重要問題。

類器官技術作為生物醫學領域的重大突破，近年來發展迅速。類器官是具有一定組織結構和功能的微型器官模型，由干細胞或組織細胞在體外培養形成，能夠模擬體內器官的發育、生理和病理過程。自2009年Hans Clevers團隊首次成功培育出腸道類器官以來，類器官技術在多個器官系統的研究取得了顯著進展。在腦血管疾病領域，類器官技術展現出了廣闊的應用前景。通過構建腦類器官，研究人員能夠在體外模擬腦血管疾病的發病機制，深入探究血管生成、神經血管單元相互作用等關鍵環節，為疾病的早期診斷、治療靶點的發現以及藥物研發提供全新的研究平臺。盡管類器官技術在腦血管疾病研究領域具有較大潛力，但目前仍面臨諸多挑戰，其中血管化問題是制約其進一步發展的關鍵瓶頸。血管化對于類器官的生長、成熟和功能維持至關重要，缺乏完善的血管系統將導致類器官內部營養和氧氣供應不足，代謝廢物堆積，影響其長期存活和功能發揮。

鑒于類器官技術在腦血管疾病研究與治療領域展現出的潛力以及面臨的挑戰，本文系統闡述類器官技術在腦血管疾病領域的應用進展，深入探討血管化腦類器官模型的構建方法，分析基于這些模型的藥物研究與疾病機制研究成果，并評估其在腦血管疾病治療方面的應用前景。

1、血管化腦類器官模型的構建

體內移植

生成血管化腦類器官的首要方法之一是將其植入動物模型中。一項研究采用慢病毒載體標記綠色熒光蛋白（GFP）的人類胚胎干細胞（hESCs）培育大腦類器官胚狀體（EBs），并在體外精心培養40～50 d，確保這些類器官具備清晰的胚體邊界、徑向排列的神經上皮及定義明確的芽。

經嚴格篩選后，這些類器官被移植至成年免疫缺陷小鼠（NOD-SCID）的壓后皮質區域。移植手術包括在小鼠大腦中制造一個空腔，將類器官植入其中，并用蓋玻片和粘合劑密封，形成顱窗，圖1展示了小鼠體內移植類器官模型構建的示意圖。

▲體內移植類器官模型示意圖

術后7～10 d，宿主血管開始侵入類器官，術后14 d可形成廣泛的血管網絡，血管化成功率達到（85.4±6.4）%，且這些血管均源自宿主。這個過程不僅顯著提高了類器官的存活率，還促進了神經元的漸進分化和成熟、神經膠質的生成、小膠質細胞的整合，以及軸突向宿主大腦多個區域延伸。通過體內雙光子成像技術，研究人員直接觀察到移植物中功能性神經元網絡和血管的存在。進一步的體內細胞外記錄結合光遺傳學技術揭示了移植物內神經元的活動，并證實了移植物與宿主大腦之間功能性突觸連接的建立。

上述發現表明，將腦類器官移植至富含血管的微環境中，可有效利用宿主血管的天然生成能力，實現類器官的血管化和功能化。總體而言，腦類器官的體內移植策略成功克服了壞死核心的限制，通過提供有效灌注顯著提升了類器官的活力。

體內移植類器官模型在一定程度上彌補了體外類器官模型中血管系統與完整人類大腦生理環境相互作用的缺失，但這一技術目前仍面臨諸多問題。首先，模型中的血管成分源自鼠類，這一特點限制了其在人類應用的可移植性，從而阻礙了模型向臨床轉化的進程。其次，目前觀察到的體內移植類器官模型類似于晚期胚胎或早期出生后的組織，其成熟度和空間結構仍與正常血管存在差距。此外，如何精確監測和量化模型的功能表現，尤其是復雜的血流變化、血管壁的應力和變形，仍是技術上的一大難題。

體外培養

類器官的內皮化

生成血管化腦類器官的關鍵挑戰是協調不同胚層和細胞命運的誘導因子，這些因子常存在相互抑制現象。因此，一些研究方案選擇分別培養腦類器官和血管類器官。也有方法通過將非外胚層來源的細胞或其祖細胞直接引入腦類器官中，形成多譜系組裝體。

一項開創性研究首次嘗試生成來源于同一患者的同源結構。該研究利用患者來源的人誘導多能干細胞（hiPSCs）分別生成腦類器官和內皮細胞（ECs），隨后在分化后進行共培養。研究中通過無翅型整合位點（Wnt）信號激活誘導中胚層細胞，并采用骨形態發生蛋白4（BMP4）、血管內皮生長因子（VEGF）和成纖維細胞生長因子2（FGF2）分化為內皮祖細胞。在分化至第34天時，將腦類器官重新嵌入含內皮祖細胞的聚合Matrigel基質膠中，繼續在體外培養3～5周，最終形成具有較強血管結構的類器官。盡管研究未對神經元區室的細胞結構進行詳細描述，但類器官中出現了多條具有穿透性和灌注功能的血管。這些血管表達了人類ECs標志物分化簇31（CD31），證明患者來源的ECs能夠成功用于腦類器官的血管化。

此后，相關研究將hESCs或hiPSCs與人類臍靜脈內皮細胞（HUVECs）共培養，成功構建了具有血管結構的腦類器官模型（vOrganoids）。在培養過程中，細胞首先聚集成胚狀體樣結構，隨后經歷神經誘導和分化。研究者發現HUVECs在vOrganoids中形成網狀和管狀結構，這些結構主要分布于腦室區/亞腦室區上方，而該區域正是神經干細胞和前體細胞的富集地。隨著發育進程的推進，血管結構不斷向新生神經元區域延伸，且這種狀態可持續200 d以上。電生理學進一步檢測顯示，vOrganoids中存在自發興奮性突觸后電流、自發抑制性突觸后電流以及雙向電傳輸現象，表明vOrganoids內部具備化學和電突觸。通過單細胞RNA測序分析，研究人員驗證了vOrganoids在細胞類型和分子屬性上與人類胎兒端腦具有高度相似性，并發現vOrganoids的發育速度相較于非血管化類器官更快。此外，體內移植實驗結果證實，vOrganoids可與宿主腦組織實現良好整合，并與宿主血管系統建立了功能性連接。

另一類腦類器官血管化策略則是通過基因改造，在腦類器官形成過程中誘導ECs分化。研究顯示，從hESCs生成人類皮質類器官，并對其進行基因改造，可異位表達人類ETS突變體2（ETV2）。ETV2能夠促使hESCs分化為ECs，這一過程不依賴特定的分化條件，也無需生長因子（如VEGF等）。實驗中確定了最佳ETV2表達細胞比例（20%），并于第18天開始誘導ETV2表達，這樣處理的類器官可有效形成血管樣結構。這些結構不僅在形態上表現為ECs標志物的表達，且在功能上可支持氧氣和營養物質的傳輸，減少細胞死亡，并促進神經元成熟。此外，這些血管化的類器官還展現出血腦屏障（BBB）特性，包括緊密連接、營養轉運蛋白和跨內皮電阻表達增加。通過單細胞轉錄組分析，研究進一步證實了血管化可促進神經元成熟。該模型的一個重要特征是血管狀結構被星形膠質細胞和周細胞包圍，與人類神經血管單元的組成非常相似。這種單一轉錄因子介導的方法可跨胚層誘導血管化，并實現類器官中細胞命運誘導時間的精準控制。

血管類器官融合

作為一種創新性可選方案，一項研究提出了混合神經血管球體新策略，以實現腦類器官的有效血管化。研究者們在hiPSCs基礎上獨立培養了誘導神經祖細胞（iNPCs）和誘導內皮細胞（iECs）的細胞球體；隨后，在兩種球體的混合培養基中加入人間充質干細胞(MSC)和SB431542、LDN193189等試劑，形成iNPC-iEC-MSC融合球體。圖2展示了體外球體融合類器官模型構建的示意圖。

▲體外球體融合類器官模型示意圖

在融合實驗中，研究者們精心調整了培養基成分，發現5%的Geltrex基質膠和0.025 wt%的透明質酸能夠顯著促進球體融合，而高濃度的ROCKi Y27632則對融合過程產生了阻礙效果。通過一系列評估手段，包括細胞增殖、代謝活性檢測、細胞因子分泌分析、神經與血管標志物的表達檢測以及基因表達分析，研究者們觀察到融合后的球體不僅成功促進了神經元和血管細胞的分化，還表現出與腦區特異性標記、基質重塑以及BBB特性相關的基因表達水平顯著上調。

此外，電生理特性測試進一步證實了融合球體衍生的細胞具備神經元功能和形態學特征。相較于傳統的直接混合方法，球體融合策略展現出了顯著優勢。該策略避免了細胞分離和重新組合的過程，減少了細胞損失，同時允許創建具有精心設計隔間的混合球體結構，從而為研究人員提供了更精準的實驗控制。此外，這種精確的排列方式通過組裝皮質球體、血管球體和MSC，促進了VEGF-A的分泌，進而加速了皮質組織發育，并展現出層次分布潛力。

生物工程技術

盡管眾多體外培養模型均出現分支血管，且其灌注能力也得到了預測或證實，但這些模型普遍存在一個缺陷，即缺乏主動血流。除此之外，在精確性、重復性、功能模擬以及實驗應用等多個方面，也存在不同程度的限制。而生物工程類技術，如3D打印技術、微流控芯片技術等相繼涌現與不斷發展，為突破這些限制帶來了新的希望與可能。

微流控芯片技術是在微米尺度上精確操控流體，集成生物、化學、醫學分析過程的技術，具有體積小、速度快、用量少等優點，適用于類器官血管化研究中精確控制微環境和細胞共培養。相關研究設計并制造了一種“開放式井”結構的微流控芯片，利用3D打印技術，并選用Dental SG樹脂作為打印材料。通過特殊的清洗程序，確保了芯片的生物相容性。該芯片中央是類器官培養室，兩側設有微流控通道，二者通過50 μm的間隙相連，允許細胞和分子交換。

血管細胞和腦類器官均從人類多能干細胞（hPSC）分化而來。在分化的第6天，血管細胞被接種至微流控通道中；而在分化的第5天，腦類器官則被接種至類器官培養室，實現了二者的共培養。在含有VEGF-A培養基的誘導下，血管細胞從微流控通道向類器官培養室伸出血管芽，形成有序的血管網絡，并與腦類器官相互作用，最終形成整合的神經血管類器官。共培養實驗結果表明，血管細胞的存在可能加速腦類器官的成熟過程。此外，生成的血管網絡不僅結構完整，且具有功能性，可進行小分子灌注和通透性實驗。

相較于體內移植模型，各種體外類器官模型具有環境變量控制性強、靈活性和重復性高、倫理問題少等一系列優勢。但體外模型無法完全再現體內復雜的生理和生物學條件、無法模擬真實的血液動力學環境，雖可通過培養不同類型的細胞模擬細胞群體和細胞間的交互作用，但其行為可能與體內復雜的組織環境不同，導致實驗結果出現偏差。對于長時間體外培養的血管化腦類器官，如何保證組織的持續生長和功能穩定也是面臨的一項技術難題。各種生物工程技術展現出了解決上述問題的潛力，但現階段在應用方面仍不夠成熟，需進一步深入研究。

2、基于血管化腦類器官的藥物研發

BBB是維持中樞神經系統穩態的關鍵屏障，其通透性調控直接關系到藥物跨屏障輸送的效率以及在腦組織中的療效，是中樞神經系統藥物研究不可忽視的重要因素。血管化腦類器官在一定程度上再現了BBB的結構與功能，為中樞神經系統藥物研發提供了一個全新平臺。Saglam-Metiner等介紹了一種ICU患者芯片平臺，該平臺將hiPSCs分化的肥大細胞與腦類器官相結合，并在三維基質中進行培養，從而成功模擬了BBB與腦組織之間的相互作用。該平臺利用一層覆蓋有人類腦微血管ECs的膜模擬血管腔與組織室的分離，部分再現了BBB的結構和功能。研究發現，異丙酚能夠激活肥大細胞、微膠質細胞和星形膠質細胞，進而增加一系列促炎基因的表達。同時，還伴隨腦組織中縫隙連接蛋白、抑制性神經遞質受體以及興奮性神經遞質受體表達水平升高。表明異丙酚可能通過激發神經炎癥反應和改變神經遞質平衡，進而影響神經元的功能和存活。

相比之下，咪達唑侖對BBB的破壞作用更為顯著，其能夠降低ECs之間的電阻值、增加屏障通透性及損傷屏障完整性。此外，咪達唑侖還可激活肥大細胞和小膠質細胞，加劇谷氨酸相關的神經毒性，并誘導白細胞介素、干擾素等炎癥因子過度表達，這些作用最終導致腦組織細胞凋亡明顯增多。咪達唑侖還抑制了抑制性神經遞質受體和興奮性神經遞質受體的表達，進一步擾亂神經遞質平衡，從而對腦組織功能造成顯著負面影響。

與傳統研究模型相比，血管化腦類器官技術結合微流控平臺更貼近人腦的生理環境，可更準確地反映藥物在腦部的作用機制，為中樞神經系統藥物研究提供了強有力工具，有助于推動相關藥物研發工作的深入開展。但BBB并非孤立存在，而是由ECs、星形膠質細胞、平滑肌細胞等共同作用維持，模擬這些周圍細胞與ECs相互作用對于再現BBB功能同樣重要，如何通過體外模型進一步復現BBB緊密連接的結構和選擇性透過藥物分子的功能是后續研究的重點。

3、腦血管疾病機制的探究

腦類器官模型在模擬人體組織三維結構及細胞間復雜相互作用方面更具精準性，為深入探究疾病發病機制帶來了獨特優勢。近期，一項研究借助腦類器官芯片，為遺傳性出血性毛細血管擴張癥（HHT）1型發病機制的研究提供了新的視角與見解。HHT是一種以血管脆弱為顯著特征的遺傳性疾病，其中HHT 1型是由

ENG（ENDOGLIN）

此外，另一項研究通過構建患者源性類器官，成功復制了腦海綿狀畸形（CCM）的特征，為深入理解CCM的發病機制提供了重要見解。CCM是一種遺傳性腦血管疾病，其特征是由眾多薄壁血管組成的海綿狀異常血管團，其易破裂出血，導致卒中和神經功能障礙。該研究觀察到，CCM患者源性的BBB類器官中內皮通道異常擴大，且通道呈現背靠背排列，這一現象與體內CCM的病理特征高度相似。進一步分析顯示，這些類器官中緊密連接蛋白和基底膜蛋白的表達顯著降低，這表明BBB的完整性受到了破壞。單細胞RNA測序揭示了ECs中病變標記基因顯著上調，以及血管生成相關基因表達增強，表明ECs的病理變化在CCM發病機制中占據主導地位。此外，研究還發現CCM患者的MSC向血管平滑肌細胞分化的潛能減弱，這種平滑肌細胞的發育損失可能是導致CCM發病的關鍵因素之一。

4、腦血管疾病治療的新策略

類器官技術作為一種新興的腦血管疾病治療策略，正展現出較大發展潛力。2020年，一項研究首次探索了腦類器官技術在缺血性卒中治療中的可行性和潛在機制。研究人員將培養了55 d的腦類器官移植至大鼠大腦中動脈閉塞模型中，發現腦類器官移植后不僅顯著減小了腦梗死體積，還顯著改善了神經功能，這種效果與腦類器官的多系分化能力密切相關。移植的腦類器官能夠模擬體內皮質發育，分化出多種細胞類型，包括神經前體細胞、神經元和星形膠質細胞等，通過神經發生、突觸重建、軸突再生和血管生成作用，促進腦損傷修復。此外，移植細胞可沿胼胝體廣泛遷移并在受損區域長時間存活。

研究還表明，卒中后6 h或24 h內移植類器官可顯著減輕腦損傷并改善行為表現，而超過7 d則移植效果有限，這一研究為腦類器官作為一種新型缺血性卒中治療策略提供了重要證據。隨后，另一項研究在該領域進一步探索，尤其是腦類器官在長期組織修復和功能恢復中的作用。研究人員利用hPSC誘導生成腦類器官，并將其移植至NOD-SCID小鼠腦梗死核心與梗死周邊交界處，數月后類器官在腦梗死核心區域內可長期存活，分化為目標神經元，形成與宿主神經網絡相連接的功能性突觸，恢復受損腦組織結構。

移植的類器官在梗死區域內分化為成熟的谷氨酸能神經元，還通過軸突延伸連接至遠端腦區，整合至宿主神經回路。這種結構修復和功能整合體現在小鼠行為改善上，包括感知和運動功能的恢復。與單一細胞移植相比，腦類器官移植表現出更高的細胞存活率、更強的組織修復能力和更優越的神經功能恢復效果。這一研究完善了腦類器官移植的實施方法，證明其可重建梗死組織并恢復卒中后功能障礙。由此可見，腦類器官為腦血管疾病的治療開辟了一條極具潛力的新途徑，其在缺血性卒中治療領域的應用前景令人期待。

5、小結與展望

類器官技術為腦血管疾病的研究和治療開辟了新視角，其在疾病機制探究、藥物研發及治療策略中的應用展現出了廣闊潛力。通過體內移植、體外培養以及生物工程技術的創新發展，血管化腦類器官的構建逐步克服了傳統模型在結構和功能上的局限，為研究神經血管單元相互作用、血管生成及BBB功能提供了更接近人體生理環境的實驗平臺。此外，這些模型在藥物篩選中實現了中樞神經系統藥物效應的精確評估，為復雜腦血管疾病的發病機制研究提供了突破性手段，在治療策略方面展現出了重要潛力。

盡管類器官技術取得了諸多進展，但仍面臨諸多挑戰。倫理問題和安全性評估是其臨床應用中的關鍵問題，特別是涉及人類干細胞問題。人類干細胞的使用（特別是胚胎干細胞），涉及倫理問題，因其來源于胚胎，且在胚胎發育過程中可能導致生命終結。為確保其倫理合規性，所有使用人類干細胞的研究均必須嚴格遵守國際倫理規范，確保研究參與者知情同意，并保證數據的透明性。

在安全性評估方面，類器官技術的臨床轉化面臨細胞異質性、免疫反應、腫瘤發生風險等挑戰。類器官在體外培養中的異質性可能導致不同患者之間的效果差異。因此，需通過嚴格的動物實驗和長時間的安全性測試評估其臨床應用風險。此外，類器官移植后可能引發免疫排斥反應、癌變風險等問題，需通過實驗數據進一步驗證，并制定詳細的安全性評估標準。

在技術實現方面，體外類器官模型在控制環境變量和倫理問題方面具有優勢，但難以完全再現體內復雜的生理環境和血液動力學，且長期培養時如何維持功能穩定仍是難題。體內移植模型雖然彌補了這一缺陷，但血管成分源自鼠類，限制了其在人體的臨床應用。此外，這些模型的成熟度和血管功能尚存在差距，血管化效率和主動灌注能力的進一步優化亟待解決。BBB的模擬也面臨挑戰，特別是如何有效復現緊密連接和藥物透過性方面，需開展進一步研究和技術突破。

結合微流控技術及高通量3D打印等前沿手段，未來有望進一步提升類器官模型的精確性和功能性。特別是在腦血管疾病領域，探索血管化腦類器官在個性化治療方面的應用潛力，如針對特定患者設計定制化的藥物篩選平臺和治療方案，將推動精準醫療的發展。與此同時，隨著生物工程技術的進步和多學科協作的深化，類器官技術有望逐步實現從實驗室到臨床的轉化，為腦血管疾病的診療帶來革命性突破。

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