DNA N6-甲基腺嘌呤（6mA）是表觀遺傳學領域近年來備受關注的一種重要修飾。越來越多的證據顯示， 6mA 參與真核生物的轉錄調控、核小體定位、 DNA 復制等過程，在壓力應激、胚胎發育、細胞生理狀態、植物生長發育、腫瘤細胞生長、免疫應答等方面發揮重要的生物學功能【1-12】。解析真核生物 6mA 調控的分子機制，是深入理解其生物學功能的關鍵。

2025 年 5 月，中國海洋大學海洋生物多樣性與進化研究所高珊教授 課題組在 Science Advances 雜志發表題為

Identification and characterization of the

de novo

methyltransferases for eukaryotic N

6

-methyladenine (6mA)

DNA 甲基化 的 完整動態調控 通路 包含建立和維持兩個過程【13-15】。 高珊教授 團隊前期 鑒定并刻畫了單細胞真核生物特有的 6mA 甲基化酶 AMT1【16】， 揭示了其特異性偏好以 ApT 雙核苷酸作為底物的特性。 團隊 最新 研究發現 ， AMT1 可以分別和 MT-A70 家族的其它兩個蛋白 AMT6 和 AMT7 形成 兩個獨立的 復合體， 通過分別識別轉錄和復制的信號，共同實現 基因組特定區域 6mA 的維持甲基化【17-18】。但 6mA 從頭甲基化如何建立，仍是一個有待解答的重要科學命題。

單細胞真核生物四膜蟲具有獨特的雙元核型（同一個細胞里有一個大核和一個小核）和有性生殖過程（接合生殖）。 無性生殖期間， 6mA 只分布于大核，在小核中完全缺失。而有性生殖時期，作為基因儲存庫 的母代小 核生成配子核、并進一步受精形成合子核。其中，部分合子核發育為子代新大核。在 此 過程中，沒有 6mA 的合子核發育成有 6mA 的新大核，會發生全基因組范圍的從頭甲基化，為尋找 6mA 從頭甲基化 酶提供 了理想的窗口期（圖1）。

圖1.四膜蟲是研究6mA從頭甲基化的理想模式：在合子核發育為子代新大核的過程中，6mA完全從頭建立。

通過同源序列比對和系統樹構建， 結合 細胞學和遺傳學驗證， 高珊教授團隊將四膜蟲 MT-A70 蛋白家族 的 7 個 6mA 甲基化酶 候選 蛋白（ AMT1-AMT7 ）劃分為不同的功能組 。如 前 所述， AMT1 分別與 AMT6 和 AMT7 協同作用，主要 執行 維持性甲基化酶的功能【17】。新近工作發現， AMT3 和 AMT4 分別 為 M ETTL14 和 M ETTL3 的同源蛋白，以 RNA 為底物催化形成 m6A 修飾 。目前 ， 僅 有 AMT2 和 AMT5 的 功能未得到驗證。

該 研究 發現， AMT2 和 AMT5 在有性生殖后期 顯著 高表達 ，且 特異性分布在新大核中，和 6mA 從頭甲基化發生的時間節點和位置都高度吻合（圖2A-B）。 為 了 驗證 二者 是否 具有 從頭甲基化酶功能， 研究 團隊構建了 AMT2 和 AMT5 單敲或雙敲 的純合株系。免疫熒光染色和 DNA 小分子質譜結果均顯示， 敲除株系中 6mA 水平較野生型 顯著 下降 ，降幅 約 為 80%（圖2C）。 回補實驗 表明 ，野生型 基因 回補可 有效 恢復 6mA 水平， 而 酶活關鍵 位點突變 的 回補 則 無法恢復，表明敲除 引起的 6mA 下降與甲基化酶活 性的 丟失直接相關（圖2C）。

為了進一步 解析 敲除株系中 6mA 模式的變化，團隊對流式分選 獲得 的 子代 新大核進行了三代單分子實時測序（ SMRT-CCS ）（圖2D）。結果 顯示 ， AMT2/AMT5 敲除 導致新大核中的 6mA 位點 顯著 減少， 而 少量 殘留位點的甲基化水平也 明顯下降。 團隊隨后進一步篩選 出一組 不依賴于維持性甲基化酶 A MT1 的位點，發現這些位點 在敲除株系中 的 甲基化水平 幾乎降至零。上述結果 以單堿基分辨 率 、 在 單分子水平上證明 了 AMT2 和 AMT5 對于新大核中 6mA 圖譜的正確建立至關重要。

圖2.AMT2和AMT5調控新大核中6mA的從頭建立。（A）AMT2和AMT5在新大核發育時期高表達；（B）AMT2和AMT5定位在新大核；（C）AMT2/AMT5敲除導致新大核6mA水平下降，野生型AMT2/AMT5回補可使新大核中6mA水平恢復，突變回補不能使6mA水平恢復；（D）SMRT-CCS結果顯示敲除株系中6mA位點數大量減少，甲基化水平顯著下降；（E）敲除株系后代中AMT1蛋白水平相比野生型上調；（F）AMT2/AMT5敲除導致后代存活率下降。

值得注意的是，殘留位點仍具有全甲基化（兩條鏈上的 A 均 被甲基化） 和 在基因 5 ’ 端核小體連接 D NA 上 富集等 特征 ，符合維持性甲基化酶 AMT1 的催化 特 性 。進一步分析發現， AMT1 在新大核發育時期高表達，并在這一時期特異性 定位 在新大核中。更為重要的是， AMT2 / AMT5 敲除細胞中的 AMT1 蛋白水平發生明顯上調（圖2E）。團隊 此前 的體外酶活實驗已 證明 ， AMT1 能夠以無甲基化 DNA 為底物進行從頭甲基化【17-18】。以上結果表明， 在合子核發育為子代新大核的過程中， A MT1 可以 在 AMT2 和 AMT5 缺失 的情況下 部分代償其功能， 發揮從頭甲基化的作用 。 但 由于缺乏 從頭甲基化酶 的 基礎 性“鋪墊” ， A MT1 的催化位點數量有限 且甲基化效率低，從 而從 另一個側面 強調了 AMT2 和 AMT5 的催化活性是新大核中 6mA 從頭建立的關鍵和限速步驟。

敲除株系中 新大核 6mA 從頭建立 的 破壞， 導致四 膜蟲 有性 生 殖 過程 出現延遲 ，后代存活率也大幅下降（圖2F）。 部分 可存活 后代在 重新 進入 無性 生殖 周期 后， 由于 AMT1 蛋白 水平的上調（圖2E）， 其 6mA 可 在整體水平上 恢復 到 與野生型 相當 ，但這些后代仍 出現 生長緩慢、提前性成熟等 異常 表型， 提示雖然 A MT1 可在一定程度上補償 6 mA 水平，但 從頭 甲基化的 精確 建立對細胞生長發育 仍有不可替代的重要作用 。

基于以上結果，團隊提出了 6mA 的調控通路 模型（圖3）： 在野生型四膜蟲 中 ，無 6mA 的合子核發育為有 6mA 的新大核的過程中， 從頭甲基化酶 AMT2 和 AMT5 將 未 甲基化的腺嘌呤 催化 為半甲基化，隨后 由 維持性甲基化酶 AMT1 將其進一步轉化為全甲基化 ； 進入 無性 生殖時期后， A MT1 的持續 高表達 確 保了 6mA 在 細胞分裂過程中的穩定遺傳。 在 AMT2/AMT5 敲除 細胞中 ， AMT1 同時 發揮 （ 較弱的 ） 從頭甲基化酶 和維持性甲基化酶 活性， 僅能 在 極少數位點 添加 6mA 且 甲基化水平 顯著偏低 ； 當細胞進入 無性 生殖時期后， AMT1 水平 的升高 使 大量未甲基化位點可以被甲基化， 但仍可能存在甲基化模式的 紊 亂 。

圖3.野生型及AMT2/AMT5敲除株系中6mA的調控通路模型。

該研究 首次鑒定并刻畫了真核生物中介導 6mA 添加的 從頭 甲基轉移酶， 揭示 了 6mA 修飾遵循建立–維持的 兩步甲基化模式 。這一發現與經典的 5- 甲基胞嘧啶（ 5mC ）形成了有趣的對應關系：二者均識別回文序列（ ApT 與 CpG ），以半保留的方式遺傳，并依賴兩步甲基化過程完成修飾。考慮到 6mA 主要存在于單細胞真核生物，而 5mC 廣泛分布于多細胞生物， 該 研究從 DNA 甲基化的角度為理解真核生物的分化與進化提供了新的視角。

Science Advances同期發表由波蘭分子和細胞生物學研究所Matthias Bochtler教授為該 研究 撰寫的題為

Introducing the

other

type of DNA methylation

該研究由中國海洋大學海洋生物多樣性與進化研究所高珊 教授課題組 完成。 高珊教授課題組 的博士生程婷、張佳晨、李海程、刁靜涵為該文章的共同第一作者 ， 高珊教授為文章的通訊作者。云南大學章文信副教授 ， 高珊 教授課題組 博士生牛俊驊 ， 日本基礎生物學研究所 Kensuke Kataoka 副研究員 、 Takayuki Kawaguchi 博士 和 Jun- ichi Nakayama 教授對本文亦有重要貢獻。

https://doi.org/10.1126/sciadv.adq4623

評論性文章鏈接：

https://doi.org/10.1126/sciadv.adx6879

制版人：十一

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