針對益生菌產品的單細胞快速鑒定、原位活力和活性檢測以及基于基因組的來源追蹤

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研究論文

●期刊:iMeta(IF 23.7)

● 原文鏈接DOI: https://doi.org/10.1002/imt2.117

● 2023年5月25日，中國科學院青島生物能源與過程研究所徐健團隊、中國食品發酵工業研究院姚粟團隊和青島東海藥業有限公司崔云龍團隊在iMeta在線聯合發表了題為 “Single-cell rapid identification, in situ viability and vitality profiling, and genome-based source-tracking for probiotics products” 的文章。

● 本文研發了一種免培養、單細胞水平、表型組-基因組結合的策略，稱為單細胞鑒定、原位活力和活性檢測以及溯源（SCIVVS），用于快速評估益生菌產品的質量。

● 第一作者：張佳、任立輝、張磊、公衍海

● 通訊作者：徐健（xujian@qibebt.ac.cn）、姚粟（su.yao@china-cicc.org）、崔云龍（cuiyunlong@qdeastsea.cn）

● 合作作者：徐騰、王曉航、郭成、翟磊、于學健、李映、朱鵬飛、陳榮澤、荊曉艷、荊功超、周世奇、徐銘悅、王琛、牛長凱、葛媛媛、馬波、尚改雙

● 主要單位：青島生物能源與過程研究所、青島東海藥業有限公司、中國食品發酵工業研究院、青島星賽生物科技有限公司、山東省能源研究院、青島新能源山東省實驗室、中國科學院大學、中國海洋大學、中國聯合網絡通信股份有限公司青島分公司

亮 點

● 本文研發了一種免培養、單細胞水平、表型組-基因組結合的策略，稱為單細胞鑒定、原位活力和活性檢測以及溯源（SCIVVS），用于快速評估益生菌產品的質量；

● SCIVVS可實現平均高達93％的鑒定準確率，并精準量化細胞活力、代謝活力以及細胞異質性；

● 同時，針對乳酸桿菌、雙歧桿菌或鏈球菌等不同種益生菌，均能產出高質量的單細胞基因組（覆蓋度可高達99.4%），從而完成精準溯源；

● SCIVVS比傳統方法快20倍，而成本僅為傳統方法的1/10，能自動化、一站式地完成產品中每個物種的細胞活力、細胞異質性測量；

● SCIVVS是一種新的技術標準，可以支撐現有益生菌和其他活細胞產品的質檢、過程監測以及知識產權保護。

摘 要

益生菌產業市場規模的的快速擴大要求快速、靈敏、全面且低成本的質量評估方法。本研究介紹了一種無需培養、單細胞水平、表型組-基因組結合的策略，稱為單細胞鑒定、原位活力和活性檢測以及溯源（SCIVVS）。基于21種法定益生菌物種的參考SCRS數據庫，可以根據單細胞拉曼光譜（SCRS）的指紋區域的不同，直接從益生菌產品出發，以93％的準確率完成菌種級別的鑒定；根據C-D峰可以準確量化細胞活力、代謝活力以及細胞異質性；對于溯源，可以利用拉曼激活單細胞分選技術（scRACS-Seq），精確的將單個細胞的基因組組裝，可達到約99.40％的基因組覆蓋率。最后，我們驗證了自動化采集的SCIVVS一體化工作流程，整個過程除測序外只需五個小時就可以完成質檢。SCIVVS比傳統方法快20倍，而成本僅為傳統方法的1/10，能自動化、一站式地完成產品中每個物種的細胞活力、細胞異質性測量，有望形成新的技術標準。

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全文解讀

引 言

益生菌是“在攝入足夠的量，會給宿主帶來健康益處的一類活性微生物”。益生菌的消費已成為全球趨勢，市場上已經有許多與健康有關的益生菌產品或正在開發中。對于這些活細胞產品的生產、消費和市場監管，其質量評估至關重要。益生菌產品必須符合質量、安全和功能方面的標準，否則不符合標準的產品會導致有益功能的喪失甚至危害健康。此外，產品聲明中核心質量參數的缺失、不完整或不準確將有礙消費者的知情權，還將阻礙政府機構和法規進行監管。益生菌產品的核心質量參數由以下4個方面組成：（i）活細胞數，（ii）菌種鑒定（ID），（iii）原位活力，（iv）溯源。然而，目前行業中廣泛應用的方法有很大的局限性。因此，為規范愈發龐大的益生菌市場，亟需建立一種快速、靈敏、精準、全面且普適的方法來評估益生菌產品的核心質量參數。

然而，每個核心質量參數的質檢都存在挑戰。(i)“活細胞數”，可以衡量細胞的整體活力，傳統方法大多數基于培養進行計數，如平板菌落計數和瓊脂擴散法；但這些常用的方法存在靈敏性差和費時費力的缺點。而且，平板菌落計數法通常是指的單菌落數而非單細胞數，而且無法統計亞致死、受損、抑制、休眠或不活躍狀態的細胞數。近年來興起的細菌計數的非培養方法，其主要基于DNA技術，例如聚合酶鏈式反應（PCR）結合乙啶單偶氮苯（EMA）或丙啶單偶氮苯（PMA），通過死細胞中DNA停止擴增的原理計算活/死細胞數，但由于試劑成本高、操作復雜以及DNA提取效率的差異導致的準確性差，限制了其在工業中的廣泛應用。

(ii)“菌種鑒定（ID）”，正確識別益生菌菌株是評估其益生菌安全性的先決條件之一。目前的檢測方法主要是基于基因型分析鑒定技術包括16S核糖體RNA（16S rRNA）基因序列、核心基因組或全基因組多位點序列類型（MLST）、擴增片段長度多態性（AFLP）和基于全基因組單核苷酸多態性（SNP）等方法。除此之外，還有基于表型分析的方法，包括基質輔助激光解吸電離-飛行時間質譜（MALDI-TOF MS）、傅里葉變換紅外（FT-IR）光譜和串聯質譜（MS/MS）等方法。然而，這些方法都是耗時、高成本和依賴培養的，這限制了其檢測不可培養細胞的應用，而且需要長達七天的時間（對于生長緩慢的菌種甚至需要更長時間）。由于需要DNA提取、文庫構建和總DNA測序，基于宏基因組學的方法是無需培養的，但由于耗時長和成本高等缺點，不適用于益生菌產品質檢。此外，宏基因組學通常無法區分細胞的死活，也無法評估細胞的原位活力。因此，我們急需一種快速、低成本且可靠的益生菌菌株識別且可以評估其原位活力的方法。

(iii)“代謝活力”是一個非常重要的概念，用于衡量活細胞在原位的代謝活力的強度，與“活性”不同，活性通常指細胞是活或死。“代謝活力”是一個關鍵的質量參數，與益生菌的功能和健康益處直接相關。目前，熒光探針、流式細胞術（FCM）和裝備有高質量圖像采集和分析系統的熒光顯微鏡等方法可以用于評估益生菌產品的“代謝活力”。然而，這些方法的缺點包括耗材昂貴、操作復雜（特別是對于沒有經驗的操作者），以及具有侵入性和不準確的分析。特別是，活細胞在熒光顯微鏡或熒光染色劑的作用下，會影響細胞的“代謝活力”。此外，細胞壁和細胞膜等結構會影響熒光探針進入細胞，從而降低熒光染色的成功率并導致結果的準確性低。由于上述方法無法深入解析單個益生菌細胞的生理狀態和代謝活動，具有很深的局限性。雖然“代謝活力”對產品功效至關重要，但尚未被廣泛采用作為益生菌質檢的評估指標。因此，我們需要一種快速、深度且可靠的方法，不僅僅檢測“活性”，還能檢測到“代謝活力”。

(iv)“溯源”是益生菌行業的一個重要需求，因為適當的知識產權（IP）保護商業菌株是創新的基石。許多益生菌菌株已被專利或保護，聲稱擁有這些權利的公司可以排除其他公司在商業產品中使用它們。此外，由于基因交換可能會將意外或甚至有害的元素（如噬菌體或抗菌素耐藥基因）引入原始菌株，因此應該監測益生菌菌株的基因組變化。因此，“溯源”不僅對IP保護很重要，也對產品的安全同樣重要。為了準確可靠地追蹤產品中的菌株，完整的基因組序列是檢驗的金標準，但測序結果通常需要長達幾周的周期，因為在基因組測序前，通常需要基于培養分離目標菌株獲得足量的純培養物。

最后，除了以上方法所述的局限性之外，如何建立一個集成和易于自動化的平臺也是關鍵挑戰，自動化的平臺可以確保流暢高效地完成所有質檢任務。目前，每個核心質量參數的檢測需要使用不同的儀器，例如用于活細胞計數需要培養箱，菌種鑒定需要使用質譜儀，檢測代謝活力需要使用流式細胞儀，以及用于溯源的測序儀，因此工作流程的集成和自動化十分困難。相比之下，擁有一個可以同時處理多個質檢任務的集成平臺有助于工作流程自動化并降低成本等優勢。

拉曼組/元拉曼組的定義為，從細胞群體或群落中獲取若干細胞的單細胞拉曼光譜（SCRS）的集合，作為單細胞水平的代謝表型，無需培養和標記，可以快速完成微生物種類的鑒定并定量檢測代謝活力（通過跟蹤D2O攝入；死細胞沒有代謝活動，因此不攝入D2O）。此外，通過開發拉曼激活細胞分選和測序（RACS-Seq）技術，從各種類型的微生物組樣本中精準的獲取表單細胞水平的代謝表型及其相對應的高覆蓋度基因組信息。

因此，我們提出了一種無需標記、單細胞精度、基因組-表型組結合的策略，利用單細胞拉曼光譜和基因組測序的互補優勢，稱為單細胞鑒定、原位活力和活性檢測與溯源（SCIVVS），并以益生菌（包括乳酸桿菌、雙歧桿菌和鏈球菌）為例進行了驗證。在SCIVVS中，使用D2O標記的單細胞拉曼顯微光譜技術，直接從產品中提取單個細胞進行總活細胞計數、菌種鑒定和物種水平的原位活力和活性檢測，而RACS-Seq（scRACS-Seq）則僅需一個細胞就可以進行基于全基因組進行來源追蹤。通過檢測實際的益生菌產品來評估SCIVVS技術，結果表明SCIVVS比傳統方法快20倍，成本僅為傳統方法的1/10，能自動化、一站式地完成產品中每個物種的細胞活力、細胞異質性測量以及高精準度的溯源。因此，SCIVVS是一種新的技術標準，可以改變當前益生菌和其他活細胞產品質檢、過程監測和知識產權保護。

結 果

SCIVVS策略概述：快速、全面評估益生菌產品質量

針對益生菌產品，傳統方法的質檢流程通常由以下四個部分組成（見圖1A）：（i）基于平板計數法進行活菌計數，需要至少三天；（ii）基于培養方法進行菌株的分離，然后進行生理生化鑒定，需要四天時間；（iii）從平板中分離純化的純培養物進行的熒光活力檢測；（iv）通過純培養物進行基因組測序進行溯源。以上全部過程都依賴于培養。因此，即使不計算測序所需時間（這取決于所選擇的測序平臺，時間差別很大），該過程通常需要至少一周時間。

相比之下，SCIVVS由三個順序步驟組成，從提取的活細胞產品中開始，以一種無需培養的方式進行（見圖1B）：（i）將益生菌細胞在100% D2O MRS液體培養基中孵育3小時；（ii）自動化采集D2O標記的SCRS，統計總活細胞計數、ID和物種水平的原位活力和活性；（iii）分選單個細胞，進行多位點擴增（MDA）和全基因組測序（通過scRACS-Seq）。由于不需要基于培養，因此可以在5小時內獲得總活菌數、ID和物種水平的原位活力和活性（而來源追蹤的時間取決于測序平臺）。

圖1. SCIVVS工作流程用于直接從商業益生菌產品中以精確的一個細胞分辨率進行活菌總數計數、快速鑒定、原位活力測試和溯源

（A）基于培養的傳統方法。（B）免培養、單細胞水平的SCIVVS方法。

在SCIVVS中直接從益生菌產品中測量總活細胞計數

由于活細胞進行代謝會攝入D2O從而形成C-D峰，其強度與細胞的活力呈正相關（通過C-D比率或CDR），基于D2O標記的拉曼光譜法，可用于益生菌產品的活細胞計數，其中細胞的代謝活性（MAL）用于指示細胞的狀態是活或死（圖S1）。為了驗證這個方案，我們選擇一個適當的D2O濃度，在該濃度下可以通過MAL值量化D2O攝入量來準確的判斷細胞的“代謝活力”。以含有植物乳桿菌的單一菌株的益生菌產品MPP-A作為測試（表S1）。在不同的D2O濃度（0%，25%，50%，75%，100%）的每個樣品采集約100個細胞的SCRS進行比較。在每個D2O濃度下，活細胞由于進行代謝合成新的生物分子的過程會形成C-D峰（2040 cm-1-2300 cm-1），具有代謝活性細胞與D2O的結合比例隨孵育時間成比例增加（圖2A）。此外，100% D2O 孵育1小時活細胞的比例為22.89 ± 0.04%，3小時活細胞的比例達到93.88 ± 0.03%，與活細胞攝入D2O的時間一致。100%D2O MRS孵育3小時后，具有代謝活性細胞與D2O的結合比例不再增加（圖2A）。

圖2. 單細胞水平下基于SCRS的MPP-A總活菌計數

（A） 在不同時間不同濃度的MPP-A的D2O MRS介質中氘摻入的強度。標記0、1、2、2.5、3、3.5和4小時的活細胞百分比。（B）基于培養的平板計數方法或免培養的SCIVVS的MPP-A的總細胞計數、活細胞計數和存活率。

為了評估在100% D2O活細胞計數的準確度，我們使用傳統方法的基于培養的方法比較了孵育前后的細胞計數結果。植物乳桿菌的活細胞計數孵育前后的結果分別為1.26 ± 0.03 × 1010 CFU/g和1.31 ± 0.05 × 1010 CFU/g（H0：p>0.05），表明3小時的100% D2O孵育不會影響活細胞計數（圖S2）。總細胞計數孵育前后的結果分別為1.84 ± 0.17 × 1010 CFU/g和2.18 ± 0.21 × 1010 CFU/g（H0：p>0.05），因此孵育過程同樣不會影響總細胞計數（圖S3）。雖然100% D2O孵育完全抑制了細胞的增殖，在較低的D2O濃度（≤75%）下發生的細胞增殖可能影響總細胞和活細胞計數結果（圖2A）：例如，在3小時的75% D2O孵育前后，活細胞計數分別為1.27 ± 0.10 × 1010 CFU/g和2.81 ± 0.09 × 1010（H1：p<0.05），表明選擇75% D2O下孵育后會導致細胞有繁殖影響活細胞計數結果（圖S2）。因此，我們選擇在100% D2O孵育3小時后的MAL作為SCRS基于活細胞計數的實驗條件（MAL≤0，死細胞；MAL>0，活細胞）。

然后，使用MPP-A測試SCIVVS方法的準確性。作為對照，傳統方法的結果均由三次平行實驗得出（圖1A；圖S2）（i）采用血球板計數法計算總細胞數（平均為1.84 ± 0.17 × 1010 CFU/g；過程需要1小時的時間），（ii）采用平板計數法計算活細胞數（平均為1.25 ± 0.45 × 1010 CFU/g；過程需要約3天的時間）（圖1A；圖S3）。

在SCIVVS中，MPP-A在100% D2O MRS培養基中厭氧孵育3小時，然后獲得SCRS的MAL值，從而獲得總細胞計數和活細胞計數結果。總細胞計數由所有的SCRS（MAL≤0和MAL>0）計算得出，而活細胞計數則由那些MAL>0的SCRS計算得出。總細胞計數和活細胞計數結果分別為1.99 ± 0.28 × 1010 CFU/g和1.35 ± 0.13 × 1010 CFU/g，實驗結果表明MPP-A存活率為67.84%（圖2B）。顯然，SCIVVS總細胞計數和活細胞計數結果與傳統方法血球板計數法（H0：p>0.05）和平板計數法（H0：p>0.05）的結果沒有明顯差異（圖2B）。因此，SCIVVS可以以無培養的方式從益生菌產品中進行準確的活細胞計數。

SCIVVS單細胞水平檢測益生菌產品中各菌種的活力

考慮CDR在測量同化活動方面的定量性質，我們假設除了檢測基于細胞死活計數的生存能力以外，還可以從直接從益生菌產品的SCRS中得出單個細胞的原位“代謝活力”。為了驗證這個假設，我們定義了rMAL（相對代謝活性水平），它是特定條件下的MAL與最優條件下的MAL（即在純培養物的對數生長期中）之間的比值，代表相對活力與峰值活力的比較。對于MPP-A產品，平均MAL和rMAL分別為0.0266 ± 0.0019和0.9331 ± 0.0016（圖2B）。因此，在短短的五個小時內，SCIVVS可以通過MAL在單個細胞分辨率下量化原位“代謝活力”，并通過rMAL量化相對代謝活力（圖2B）。

快速測量單個細胞代謝活力可以拓展應用于很多場景中。例如，可以評估微囊化對產品活力的影響。例如，兩種相同B. infantis菌株的益生菌產品X和Y，其中一種有微囊化，另一種沒有微囊化（圖3A；表S1）。然而，產品X和產品Y基于培養的傳統方法檢測活細胞數的結果分別為3.40 ± 0.36×109 CFU/g和2.51 ± 0.06 ×109 CFU/g，表明其生存能力基本相同（表S2）。因此，為了探究微囊化對產品活力的影響，必須進行耗時的加速實驗（也稱為穩定性測試；在該實驗中，兩種產品都在高溫37°C下孵育10天，模擬細胞應激反應，從而推導出活力），然后再次基于傳統的平板計數法確定活細胞數。加速實驗后產品X和產品Y的活細胞計數結果分別為3.57 ± 0.25 × 107 CFU/g和2.08 ± 0.14 × 109 CFU/g（表S2），其生存率結果分別為1.05％和82.76％。因此，產品Y的生存能力比產品X更穩定，這表明微囊化對保持產品功效是有效的。顯然，這種質量評估過程包括長達10天的加速實驗以及實驗前后每種基于培養的活細胞計數需要超過3天的時間，非常耗時和低效。

圖3. 單細胞水平下基于SCRS的益生菌原位代謝活力測試

A）不同加工技術的工作流程（有或沒有微膠囊）。還顯示了產品X和產品Y的MAL值（B）和異質性指數（HI；C），這兩種產品都用100%D2O MRS培養基孵育3小時。

相比之下，通過快速定量地檢測細胞活力，基于SCRS的方法極大地簡化了評估過程，僅需5個小時的活力檢測能輕易的區分出兩種產品（不再需要進行10天的加速實驗）。實驗結果表明，在加速實驗之前，基于SCRS的方法中得出的產品X和產品Y的平均MAL值分別為0.0056（MALProductX = 0.0140-0.0084）和0.0172（MALProductY = 0.0247 - 0.0075）（圖3B），實驗結果表明產品Y的細胞活力是產品X的兩倍以上。同時，通過SCRS檢測產品X和Y的活細胞計數結果（在進行任何加速實驗之前）分別為3.43 ± 0.18 × 109 CFU/g和2..65 ± 0.18 × 109CFU/g（表S2），與傳統方法平板計數法的計數結果一致（H0：p > 0.05）。因此，通過利用SCIVVS測量活力而不僅僅可以檢測生存能力，還可以定量代謝活力從而更靈敏地評估微囊化的效果，而無需進行耗時的加速實驗。

此外，SCRS可以量化細胞內活力的異質性程度。我們提出了一個稱為MAL的異質性指數（MAL-HI）的參數，定義為從益生菌產品中采樣的單個細胞的MAL的標準差（SD）。值得注意的是，MAL-HIProductX（為0.012）顯著高于MAL-HIProductY（為0.009），表明微囊化制造的B. infantis單個細胞的代謝活力不僅更高，而且更均勻（圖3C）。因此，對于具有相同活細胞計數的益生菌產品，SCIVVS可以迅速揭示代謝活力水平和異質性（即同步度）。這種量化益生菌活力的能力可以避免進行耗時的加速實驗，高活力的細胞可以更好地耐受高壓環境。

SCIVVS可以直接在單細胞水平實現益生菌產品的快速菌種鑒定

在單一或多菌種益生菌產品的質量評估中，快速鑒定細菌菌株是非常重要的。然而，現有的基于培養、質譜或宏基因組的方法可能需要長達數天的檢測時間。為了建立一種快速（即幾分鐘內）和低成本的SCRS鑒定方法，該方法不依賴于培養或測序，首先，建立了一個21個純培養的益生菌菌株的SCRS參考數據庫，以上菌株均為標準法定菌株（包括14個Lactobacillus spp.、6個Bifidobacterium spp.和1個Streptococcus sp. 表S3）。每個純培養的菌株中采集了100多個細胞的SCRS（圖4A）。使用一維光譜作為輸入的深度學習模型，CNN（卷積神經網絡）架構包括18層（17個一維卷積層和殘差連接加上一個全連接層；圖4B；方法）。采用大規模卷積而不是全局平均池化層，以保留光譜峰值的確切位置。

圖4. 商業益生菌產品的基于SCRS的益生菌菌種鑒定

（A）21個標準法定益生菌菌株的平均SCRS以粗體顯示，并覆蓋在每個菌株的SCRS的代表性實例上。（B）21個菌株類別的混淆矩陣。條目i，j表示在給定類別i的基本事實的情況下由CNN預測為類別j的測試光譜的百分比；沿對角線的條目表示每個類別的精度。（C）使用總共18層的一維殘差網絡，將SCRS分類為21個應變類別之一。（D）不同比例的植物乳桿菌299V光譜和非植物乳桿菌的模擬樣品的預測相對豐度和真實相對豐度的性能比較。

該神經網絡的任務被配置為21類分類，其中CNN輸出跨越21個訓練類的概率分布，然后取最大值作為預測類別。使用3546個SCRS的訓練數據集和1519個SCRS的測試數據集作為輸入（表S3）。個別類別的性能分解表明，在21類任務中，基于SCRS的ID的平均準確性為93.02±1.39%（±計算為三個驗證拆分的標準差；圖4C）。遠遠高于隨機森林（RF）和支持向量機的準確性（SVM；分別為59.16%和70.27%）。CNN模型報告了93.02±1.39%的鑒定準確性，因此SCRS能夠可靠地區分14個Lactobacillus spp.、6個Bifidobacterium spp.和1個Streptococcus sp.的純培養菌株。

接下來，為了測試該CNN模型在菌種鑒定方面的準確性，將L. plantarum 299V和包含相等數量的20個標準法定益生菌菌株的混合物庫進行模擬微生物群落的構建（1:99、5:95、10:90、20:80、50:50、80:20、95:5和99:1；稱為Mock-1、Mock-5、Mock-10、Mock-20、Mock-50、Mock-80、Mock-95、Mock-99；圖4D）。對于每個模擬益生菌樣品，使用CNN模型進行10次隨機SCRS鑒定實驗。在每個實驗中，L. plantarum 299V在模擬群落中的比例被準確重構（預測和實際結果之間的差異<3.5%；圖4D）。因此，該模型可以準確區分L. plantarum 299V單個細胞和其他益生菌細胞。

此外，我們測試了這個CNN模型是否可以直接從MPP-A產品中鑒定單個益生菌細胞。為了完成這個任務，添加MPP-A的L. plantarum 299V的SCRS優化參考數據庫（表S1）。然后對MPP-A產品進行檢測，詳細步驟如下所述，MPP-A在100% D2O MRS中厭氧孵育3小時，將孵育后的樣品等分成三份，其中兩個等分分別進行了基于16S-rDNA的擴增子測序和宏基因組測序作為對照實驗，兩者測序結果表明L. plantarum為MPP-A產品主要成分。另一份經過兩次洗滌，進行單個細胞的SCRS鑒定，其中平均92.72%的SCRS被CNN模型預測為L. plantarum。以上三種方法均證明了L. plantarum為MPP-A唯一主要成分的結果（圖4；表S4），所以，基于SCRS的CNN模型可以在沒有純培養的情況下直接從實際益生菌產品中準確鑒定L. plantarum單細胞。

基于scRACS-Seq，SCIVVS可直接基于單細胞基因組序列對益生菌產品溯源

由于獲得SCRS是無損的，直接從益生菌產品中提取的單個細菌細胞可以通過RACS和單細胞全基因組測序（scRACS-Seq）進行來源追蹤（圖5A）。為了驗證這種方法的準確性，首先選用了復合型益生菌產品CPP-A的其中一種菌株L. rhamnosus進行測試（表S1）。

制備樣品A進行基準測試，其樣品A中包含L. rhamnosus。通過我們引入的拉曼激活重力驅動單細胞封裝（RAGE）芯片，單個細胞分別分選到微小液滴中，裂解并通過多重置換擴增技術（MDA）在單細胞水平下擴增DNA（方法）。然后，A1-A4細胞（全部來自樣品A）和O5（不含任何細胞的空液滴；作為陰性對照）進行了16S rDNA基因測序，測序結果證實A1-A4細胞均為L. rhamnosus（圖S4A；表S5）。除此之外，還對A1細胞進行了鳥槍測序，將303萬組裝成完整基因組（完整度為93.53％；污染率為1.84％；表1）。基因組比對確定A1細胞為L. rhamnosus，與16S rRNA測序結果一致。

表1. 通過SCRACS-SEQ方法直接從商業益生菌產品中對單個細菌細胞進行精確的單細胞基因組測序。對于樣品B，我們以單細胞單管的方式分選了15個單細胞，其中選擇了三個細胞進行全基因組測序，每個細胞代表不同的細菌種類，如表所示。

接下來，我們設計了一個模擬微生物群落（L. paracasei vs L. rhamnosus vs L. plantarum=1:1:1，均來自CPP-A）獲得樣品B。然后對B1~15細胞（來自樣品B）和O16（不含任何細胞的空液滴；作為陰性對照）進行了單細胞分離、裂解和DNA擴增，并進行了測序。16S rRNA基因序列確定B3、B6、B10為L. plantarum，B4、B7、B9為L. paracasei，B1、B8、B11、B13為L. rhamnosus（圖S4B；表S5）。對于B1、B3和B4細胞，使用HiSeq平臺測得了2.99、3.41和3.21百萬對讀取，分別組裝成了近完整的單細胞組裝基因組（SAGs），其完整度分別為97.53％、96.58％和99.40％，污染率分別為1.91％、4.41％和1.25％（表1）。這些高質量的單細胞基因組將B1、B3和B4細胞鑒定為L. rhamnosus、L. plantarum和L. paracasei，與基于單個16S rRNA的ID結果一致（表1）。

圖5. 通過scRACS-Seq直接從商業益生菌產品中精準追蹤的單細菌細胞來源

（A）與基于培養的傳統方法相比，scRACS-Seq工作流程用于商業益生菌產品的溯源。比較了乳酸桿菌純培養的SCIVVS和大量益生菌產品的基因組測序。對于乳桿菌屬的純培養，分別分選并測序三個細胞（B1、B3、B4）。對于益生菌產品，16個細胞（C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16）被分選和測序。（B）基于CheckM估計的SAG的完整性。（C）基于N50長度的從頭組裝的連續性。（D）從頭組裝開采的CDS區域數量。（E）從從頭組裝中挖掘的tRNA類型的數量。

為了測試精確的單細胞衍生SAG與傳統的純培養衍生基因組之間的質量是否存在差異，還將CPP-A中的L. paracasei、L. plantarum和L. rhamnosus菌株進行分離純化并擴大培養后進行了鳥槍測序和組裝，實驗結果表明平均N50為148.28 Kbp，基因組完整度為99.43±0.05％（圖5B-E）。特別是，以上三個SAG的質量都與純培養衍生的組裝質量相當（表1；圖5B-E）。因此，SCIVVS可以產生高質量的單細胞基因組序列，可在單個細胞水平下精準地追蹤益生菌產品的菌株來源。

自動化和一體化SCIVVS流程評估復合型益生菌產品質量

在SCIVVS中，活細胞數量、ID和種屬水平的存活率和活力等指標的檢測均是來自于SCRS，因此，實現自動化是提高SCIVVS采集SCRS通量的關鍵。為了實現這一目標，測試了各種智能單細胞分割和定位的方法，并進行比較（圖6A）。Canny和Sobel在圖像分割方面的準確性均<80%（Canny：ACC=61.3%；Sobel：ACC=75%）。這些方法使用閾值判斷和梯度計算進行邊緣檢測，受圖像質量影響很大；此外，確定閾值值很困難，需要根據圖像質量進行調整。因此，Canny和Sobel只適用于分割稀疏和清晰的細胞圖像，而不適用于密集模糊的細胞圖像。全卷積網絡（FCN）是一種監督學習分割方法，顯示了88.7%的準確性。然而，在池化過程中會失去大量信息，降低分割準確性。擴張卷積網絡（DCN）的性能最高（95.8%的準確性），尤其適用于帶雜質的圖像。在DCN中，圖像中的雜質像素被標記為背景，并被賦予低權重以幫助準確分類；此外，細胞粘附大大降低，進一步細化分割結果并提高準確性（圖6B）。

因此，自動化SCRS采集過程包括圖像對焦、單個細胞分割和定位、SCRS收集和質量評估加篩選。為了評估其性能，我們通過自動化采集和手動方法采集了MPP-A產品（表S1）的SCRS。對于SNR（信噪比），兩種方法之間沒有顯著差異，表明光譜質量相當（圖6C）。然而，自動化方法數據采集比手動方法平均快10.9倍，比如，分別比數據集A、B和C快9.5倍、12.6倍和10.6倍（每個數據集進行了三次實驗），（圖6D）。因此，我們的自動化程序可以取代繁瑣的手動SCRS采集過程。

圖6. 通過SCIVVS進行益生菌質量評估的自動SCRS采集

（A）不同算法下的分割比較。ACC：準確度；IoU：聯邦上的交叉點；FPR：假陽性率；FNR：假陰性率；OER：總體錯誤率。較高的ACC和IoU表示更準確的分割。相比之下，FPR、FNR和OER中的較小者意味著更好的分割結果。（B）應用Sobel、FCN和DCN算法對植物乳桿菌細胞進行典型分割的結果圖。圖像中的紅色標記表示分割中的錯誤。基于與手動操作（通過專家用戶）的比較，對于包括SNR（C）和吞吐量（D）在內的兩個性能參數，自動采集的優勢是顯而易見的。

接下來，以復合型益生菌產品CPP-A（表S1）為例，驗證商業益生菌產品的自動化的SCIVVS工作流程。

步驟1. CPP-A的總活細胞計數

為了確定最佳孵育時間，將CPP-A溶解于100% D2O MRS中孵育不同時后進行檢測。和之前的孵育實驗結果一致，在3小時后，活細胞的比例達到了96.33±0.009%，隨著孵育時間增加，活細胞的比例沒有再增加（圖S5）。因此，對于CPP-A，3小時100% D2O 孵育后的MAL為默認值進行活細胞計數。因此，總細胞數和總活細胞數分別為4.13±0.03×1011 CFU/g和3.84±0.02×1011 CFU/g。此外，92.98%的是活細胞，其余（7.02%）是死細胞。SCIVVS的結果與血細胞計數（總細胞數為4.09±0.07×1011 CFU/g；H0：p>0.05）和平板計數結果一致（3.72±0.35×1011 CFU/g；H0：p>0.05；根據混合到CPP‐A之前的五種純培養物的結果；圖7A）。

步驟2. 菌株鑒定

首先，建立復合型益生菌產品CPP-A中的五種菌株參考SCRS數據庫，包括L. plantarum、L. paracasei、B. coagulans、B. animalis和L. rhamnosus，其中每個純培養物的細胞在100% D2O中孵育3小時，并通過532 nm激光獲取SCRS（圖7B）。ID任務被配置為5類，其中CNN輸出在五個訓練類的概率分布，并取最大值作為預測類。訓練數據集包含1602個SCRS，測試數據集包含401個SCRS（表S6）。針對各個類別的性能分解表明，在五類任務中，基于SCRS的ID的平均準確率為94.93±0.01%（±被計算為三個驗證分割的標準偏差；圖7C）。因此，該模型ID準確率為94.93±0.01%，表明可以準確地區分CPP-A中的五種菌株。

圖7. SCIVVS應用于復合益生菌產品質量評估的一體化工作流程

（A）基于平板計數或SCIVVS評估的CPP-A的總細胞計數、活細胞計數和存活率。（B）來自CPP-A的5種純益生菌菌株（植物乳桿菌、副干酪乳桿菌、凝結乳桿菌、動物乳桿菌和鼠李糖乳桿菌）的平均拉曼光譜以粗體顯示，并覆蓋在每個菌株的SCRS的代表性實例上。（C）5個菌株類別的混淆矩陣。（D）在CPP-A中活菌株的預測比例。（E）CPP-A中的每個活菌株的代謝活性水平（MAL）。（F）CPP‐A的異質性指數（HI）和CPP‐A中各活菌的異質性指數。（G）CPP-A的相對代謝活性水平（rMAL）和CPP-A中每個活菌株的相對代謝活性水平。從實際的益生菌產品中，通過SCIVVS方法對16個單細胞（C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16）進行了分類和測序。（H）核心基因組SNPs數量與SAGs完整性之間的關系。顯示了使用C2細胞（具有最高覆蓋率的副干酪乳桿菌細胞；I）或C10細胞（具有最低覆蓋度的副干酪乳酸桿菌細胞；J）的SNPs重建的系統發育樹。基于串聯SNP位點的Jukes-Cantor距離，使用FastTree構建最大似然樹。引導置信度值（以百分比表示）顯示在每個分支的上方。比例尺表示0.02或0.002的Jukes-Cantor距離。來自真正益生菌產品的單細胞由黑圈表示；基于批量培養的測序結果用黑色三角形表示。高覆蓋率和低覆蓋率SAG都與參考基因組聚集在同一系統發育分支中。

為了測試直接從產品中進行ID的可行性，將CPP-A在100%D2O中孵育3小時，直接從從CPP-A中提取的細胞混合物中獲取了約400個SCRS。使用上述CNN模型，預測的CPP-A中五個菌株的活細胞比例分別為26.79±0.01%、54.22±0.03%、2.28±0.01%、15.66±0.01%和1.05±0.01%（圖7D；表S7）。五個純培養物的混合到CPP-A中之前平板計數法的活細胞計數結果，L. plantarum、L. paracasei、B. coagulans、B. animalis和L. rhamnosus的活細胞比例分別為26.24%、54.10%、2.02%、17.08%和0.56%。在三個平行實驗中，χ2分別為0.9827、9.9214和2.3264，說明盡管不同菌株之間的相對比例波動范圍較大（約100倍），但預測比例與實際比例一致性較高（χ2≤11.070，認為兩者一致的）。因此，基于SCRS的ID可以準確地鑒定CPP-A中的五個菌株。

步驟3. 在物種水平解析活細胞計數、原位活力和活力異質性指標

基于每個益生菌細胞的SCRS進行ID，可以得到CPP-A中的每個菌株的活細胞計數和原位活力。具體來說，五種菌株的活細胞計數分別為1.03±0.04×1011 CFU/g、2.08±0.10×1011 CFU/g、8.76±0.03×109 CFU/g、6.01±0.05×1010 CFU/g和4.03±0.02×109 CFU/g（表S7）。

此外，基于MAL、HI和rMAL概念，可以揭示CPP-A的代謝活力（絕對和相對）和活力異質性，包括產品整體和CPP-A中每個活菌株（圖7E-G）：MALCPP-A = 0.02，rMALCPP-A = 0.53，HICPP-A = 0.01。另外，SCIVVS測得的活細胞率與傳統方法的結果一致（表S7）。因此，SCIVVS可在菌株和單細胞水平直接從復合益生菌產品中精準量化以上指標。

步驟4. 溯源

對于這項任務，從CPP-A提取的細胞被單獨分選到微小的液滴中，在水生相中進行裂解和擴增，以進行全基因組測序，這是通過單細胞RAGE-Seq實現的，該整個分選過程在水生相中進行，以保護細胞的活力和基因組完整性。具體而言，從CPP-A中分別選取C1~C16個細胞和O11（不含細胞的空液滴作為陰性對照），然后以一細胞一管的方式進行裂解和擴增（表1；方法）。單細胞16S rRNA基因測序揭示CPP-A中的C3、C6、C7、C9、C11、C13、C15為L. plantarum，C1、C2、C4、C5、C8、C10、C12、C14、C16為L. paracasei，它們都是CPP-A的主要成分（表S5）。相應的一細胞全基因組測序揭示了一細胞SAGs的高質量（圖5B-E）：（i）平均完整性為81.79%，即與從小鼠糞便中用凝膠珠單獨分離的單一益生菌細胞（“SAG-gel”平臺）無顯著差異（Wilcoxon檢驗；p > 0.05）；（ii）基于contig N50，兩個平臺的SAGs的連續性相似（Wilcoxon檢驗；p > 0.05）；（iii）來自SCIVVS的SAGs恢復了比SAG-gel平臺的SAGs更多的編碼蛋白基因（平均2561個對1958個；Wilcoxon檢驗，p < 0.05）；（iv）從兩個平臺恢復的tRNA基因類型相似（Wilcoxon檢驗，p > 0.05）。因此，SCIVVS不僅獲得了每個細胞的代謝表型，還產生了與SAG-gel平臺相當的質量的SAGs。

由SCIVVS導出的一細胞SAGs使得乳酸桿菌菌株之間產生了高分辨率的基因組比較（表1）。為了測試基于SAGs的SNP譜系追蹤的可能性，構建了一個包括從CPP-A中純培養衍生的L. paracasei基因組和從NCBI RefSeq數據庫檢索的283個L. paracasei基因組的基因組數據庫（“LpaDB”）（方法）。在LpaDB中，約78%的基因組共享完全相同的16S序列，表明16S-rDNA基因組學在這種情況下的分辨率不足以進行源追蹤。為了測試是否可以獲得足夠的單核苷酸多態性（SNP）來區分菌株，使用Parsnp分別為SCIVVS導出的SAGs分析了核心基因組SNP。核心基因組SNP的數量與SAGs的完整性呈正相關關系（圖7H）。對于覆蓋率為99.07%的高覆蓋率SAG C2，獲得了27,961個核心基因組SNP；使用這些SNP重建的系統發育樹顯示，直接從CPP-A分選的L. paracasei SAG C2與純培養中衍生的L. paracasei基因組正確聚類（圖7I），表明它們具有相同的起源。值得注意的是，對于覆蓋率最低的SAG C10（覆蓋率為46.28%），C10的L. paracasei基因組也被準確地放置在系統發育樹上（圖7J）。對于L. plantarum的SAGs，在一細胞基因組覆蓋率為68.68%至90.72%的情況下，也獲得了準確的源追蹤結果（表1；圖S6）。因此，通過從益生菌產品的細胞提取物中直接進行單細胞RAGE-Seq導出的一細胞SAGs，無論菌株的可培養性如何，都足以支持敏感和可靠的源追蹤。

基于我們對實驗持續時間和消耗品成本的估計，SCIVVS需要約5小時和4.39美元進行全面的質量評估過程，包括活細胞計數、ID、原位活力評估（表S8），并需要額外的約10小時和1.12美元用于DNA制備以進行溯源（單細胞分選、裂解和MDA反應）。相比之下，傳統方法需要9~11天并且需要高達 $33.31~$58.61的成本進行活細胞計數、ID和活力檢測（通過細胞計數儀），并需要額外的約5天和3.90美元進行DNA制備以進行溯源（平板培養、菌落挑選、液體培養，然后從批量培養中提取DNA）。因此，SCIVVS的速度可以達到傳統方法的20倍以上，而成本則降低了一個數量級（表2）。

表2. 傳統方法和SCIVVS方法對益生菌產品質量評價參數的比較

1三個步驟的成本或持續時間，包括稀釋、菌落采集和液體培養以及DNA提取。2兩個步驟的成本或持續時間，包括直接從樣品中進行單細胞分選，然后進行細胞裂解和MDA反應。由于基因組測序的成本或持續時間取決于所選擇的特定測序平臺，因此源追蹤的估計不包括測序步驟。

討 論

像SCIVVS這樣綜合快速活菌計數、鑒定、原位活力測試和單細胞水平的基因組溯源的綜合方法可以解決益生菌產品質量檢驗中的挑戰。SCIVVS利用直接從產品中獲取D2O探測的SCRS，而不是基于培養的平板計數菌落：指紋區域基于常見益生菌菌種的參考SCRS數據庫高精度地對細胞進行物種級鑒定，而根據C-D峰通過得出絕對和相對MAL可準確量化總活細胞計數和代謝活力。此外，為了追蹤目標菌株的來源，可以進一步進行單細胞基因組組裝的scRACS-Seq，該技術可基于單細胞的基因組組裝，對于多種乳酸桿菌、雙歧桿菌和鏈球菌等菌株高達> 99%的基因組覆蓋率。此外，我們還展示了具有自動化SCRS獲取的集成SCIVVS工作流程，并通過實際的單菌株和多菌株益生菌產品驗證了該工作流程。

SCIVVS采用了拉曼顯微光譜、單細胞分選、裂解和DNA擴增的RAGE芯片的集成設計，將基于SCRS的非侵入性代謝表型組學與下游單細胞基因組測序直接耦合，實現了代謝表型導向的單細胞測序。該設計充分利用了快速鑒定、活力、生存能力測試中的快速和通量以及溯源中的高分辨率。相比于基于基因組的應用，這種基于代謝表型的單細胞測序方法在處理大批量樣本時具有更大的優勢，因為快速和通量是處理大樣本量時必須考慮的因素，而基于基因組的應用只針對特定的樣本進行。

盡管SCIVVS具有強大的優勢，但需要進一步發展以測試和擴展其全部潛力。例如，本研究僅包括21種益生菌的標準法定菌株（全部來自產乳酸菌的物種）作為參考拉曼組數據庫用于鑒定，而該方法是否可以擴展應用到到其他益生菌，如芽孢菌、丙酸菌和酵母菌等，還不清楚。此外，由于SCRS對細胞的分類和生理狀態均敏感，當益生菌產品中的物種或菌株數量進一步增加時，SCRS是否可以準確地鑒定，盡管我們之前對超過兩組的微藻物種的研究結果表面利用SCRS可以區分細胞種類和狀態。因此，參考SCRS數據庫應擴大范圍包括更多的物種和更多的生理狀態，以便充分測試基于SCRS的物種識別的范圍和分辨率。此外，通過采用拉曼流式細胞術，如FlowRACS，可以進一步提高SCRS獲取的速度。在分選步驟中，新的RAGE芯片設計可提高細胞捕獲的精度，例如光學鉗子輔助池篩或使用人工智能自動分選細胞，也可以增加SCIVVS的通量。此外，需要采用單細胞基因組測序技術，以實現更高質量，更具成本效益的大量分選細胞的測序。

在單細胞水平進行質量評估具有深刻的意義。例如，由于原始樣品中的一個細胞對應于瓊脂板上的一個菌落（~109個細胞），SCIVVS中的單細胞表型組-基因組分析可以直接跳過耗時的細胞分離和純培養步驟，而不會犧牲任何分辨率（至少在理論上）；相反，該方法能夠提供更準確的基因型和表型的多樣性和結構圖像，因為基于瓊脂板的分離和培養步驟往往會因物種生長速率的變化而扭曲或誤代表原始樣品。特別是，由于SCIVVS可以檢測所有的細胞，包括活躍和休眠（即不活躍但仍然存活）細胞，而傳統的瓊脂板計數方法只會偏向那些活躍或快速生長的細胞，理論上SCIVVS可以計數更多的細胞。這可能非常重要，特別是對于從食品產品（或其他類型的樣品）中準確檢測和計數病原菌，目前監管機構的質量標準通常基于平板計數結果。因此，這種一站式進行單細胞代謝表型組學和基因組學分析的技術將為益生菌產品質量評估帶來新的標準。考慮到來自美國、中國、意大利、保加利亞等各個地區的商業益生菌產品已經得到評估，但由于國家之間的差異和缺乏從菌株鑒定到表型分析的準確方法，監管標準尚未廣泛制定。實際上，歐洲正在呼吁將質量概念修訂為更全面的方法，并引入工具來評估高質量益生菌制劑的價值。因此，基于SCIVVS的單細胞代謝表型組學和基因組學將成為一種有利的質量評估方法，以及一種普遍適用的質量評估數據庫，支持益生菌和其他活細胞產品的質量控制、過程監控和知識產權保護的新一代標準。

結 論

SCIVVS方法是一種全面有效的益生菌產品質量檢測解決方案，提供快速活菌計數、ID、原位活力檢測和基于基因組的溯源，最終完成單細菌細胞水平的評估。它充分利用了拉曼顯微光譜法在活菌計數、ID和原位活力測試中的快速和高通量，以及源追蹤中靶向單細胞基因組測序的高分辨率，因此適合在工業生產環境中處理所需的大樣本量。由于SCIVVS速度快20倍以上，價格便宜10倍以上，具有活力和異質性揭示、易于自動化的特點，它是一種新的技術和數據框架，適用于活細胞產品的質量評估，無論是益生菌、人類、動物、高等植物還是藻類細胞制劑。

材料與方法

益生菌菌株和產品在本研究中測試了21種益生菌標準菌株（表S3）。它們被列入歐洲食品藥品監督管理局2007年批準的《微生物安全性合格推定》。根據中國衛生部2010年批準的《可用于食品的微生物培養物名錄》，這些物種在中國也可用于食品。所有菌株均購自中國工業培養物保藏中心（CN），但DSM 20555、DSM 20072和DSM 9843均購自德國微生物保藏中心（DE），BNCC 341709均購自北納生物（CN）。MRS和BS培養液均來自海博生物技術公司（CN）。生理鹽水和Tween 20來自生工生物工程有限公司（CN）。用于細胞氘標記的D2O來自Sigma-Aldrich Co（美國）。用D2O溶解的MRS培養基通過0.22μm PES膜過濾器（US）過濾。

來自仁和集團（CN）的MPP-A是單一菌株（植物乳桿菌299V）產品（目錄號：6973601560317），購自京東（CN）。CPP-A是五種益生菌菌株（植物乳桿菌、副干酪乳桿菌、凝結芽孢桿菌、長雙歧桿菌和嬰兒雙歧桿菌）的混合物，由青島東海制藥有限公司提供（CN）。

基于SCIVVS的益生菌產品質量控制過程

如前所述，所有SCRS均在RACS-Seq儀器（單細胞中心）上獲得。對于單細胞快速ID，首先構建了參考SCRS數據庫，并使用卷積神經網絡基于該數據庫對單個細胞進行分類。代謝活力和活細胞計數是基于?SCRS的C-D峰（2040 cm-1-2300 cm-1），通過代謝活性水平（MAL）和相對代謝活動水平檢測（rMAL）。單細胞源追蹤是通過RACS-Seq儀器以單細胞單管方式對RACS分選的益生菌細胞進行多次置換擴增和測序來實現的。補充方法中提供了方法的全部細節。

數據可用性聲明

將本研究中報告的序列數據存入NCBI SRA數據庫（BioProject ID:PRJNA917206；https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA917206)。支持信息（圖表、腳本、圖形摘要、幻燈片、視頻、中文翻譯版本和更新材料）可在在線DOI或iMeta Science中找到http://www.imeta.science/.

引文格式：

Jia Zhang#, Lihui Ren#, Lei Zhang#, Yanhai Gong#, Teng Xu, Xiaohang Wang, Cheng Guo, Lei Zhai, Xuejian Yu, Ying Li, Pengfei Zhu, Rongze Chen, Xiaoyan Jing, Gongchao Jing, Shiqi Zhou, Mingyue Xu, Chen Wang, Changkai Niu, Yuanyuan Ge, Bo Ma, Gaishuang Shang, Yunlong Cui*, Su Yao*, Jian Xu*. Single-cell rapid identification, in situ viability and vitality profiling, and genome-based source tracking for probiotics products.iMeta, 2023.. https://doi.org/10.1002/imt2.117

作者簡介

張佳（第一作者）

● 中國科學院青島生物能源與過程研究所副研究員、單細胞中心工具酶團隊負責人。

● 已發表SCI論文10余篇，申請專利30余項，主持軍委科技委項目、國家青年科學基金、省項目、橫向項目等7項，累計經費628萬元。獲“清源學者”人才計劃（2023）等支持。主要從事基因合成、酶工程、代謝工程、益生菌的研究等方向。

任立輝（第一作者）

● 中國科學院青島生物能源與過程研究所高級工程師、單細胞中心儀器工程軟件組負責人。

● 主持國家重點研發計劃課題、軍委科技委儀器研制項目、國家重大科學儀器研制課題和國家青年科學基金等，累計經費1000余萬元。獲“清源學者”人才計劃（2023）等支持。主要研究重點是借助于拉曼技術，進行單細胞檢測儀器軟件系統開發和拉曼組技術研究工作。

張磊（第一作者）

● 博士后，山東聯通工業互聯網首席專家，中國人工智能學會會員，全國創新創業優秀博士后。

● 主要研究方向為數據智能和工業互聯網，作為主要參與人參與了國家重點研發計劃等多個國家/省/市級科研課題，負責多項企業橫向合作項目，在相關領域產出多項學術成果。榮獲第一屆全國博士后創新創業大賽創新賽銅獎，2021中國·山東(青島)博士后創新創業成果大賽創業組銅獎。

公衍海（第一作者）

● 中國科學院青島生物能源與過程研究所助理研究員、高級系統架構設計師。

● 主要從事單細胞基因組學、生物信息學與系統生物學等研究方向。已發表SCI論文10余篇，研發了微擬球藻設計與合成數據庫系統、單細胞基因組與拉曼組數據分析系統等生物信息學工具，獲得軟件著作權6項。

徐健（通訊作者）

● 中國科學院青島生物能源與過程研究所研究員、單細胞中心主任。

● 論文發表于Science、Cell Host Microbe 等170余篇，被引超15000次，H-index 60。獲國家高端人才計劃（2012；2019）、國家杰出青年基金（2014）、中國青年科技獎（2015）、科技部創新人才推進計劃（2015）、中源協和生命醫學創新突破獎（2016）、泰山學者等支持。在單細胞分析技術與儀器方面，單細胞中心團隊提出了拉曼組（ramanome）、基于代謝活性的最小抑菌濃度（MIC-MA）等概念，研制和產業化了單細胞拉曼科學儀器系列（CAST-R、FlowRACS、RACS-Seq、EasySort等），開發了菌群大數據搜索引擎（MSE）等，服務于微生物組、精準用藥、合成生物學、生物安全等廣闊領域。

姚粟（通訊作者）

● 中國食品發酵工業研究院副院長、中國微生物學會工業微生物專業委員會主任委員、山東省泰山產業領軍人才、新疆自治區高層次引進人才、國際乳品聯合會(IDF)中國國家委員會副主席、國際乳品聯合會(IDF)微生物分析方法委員會主席。

● 長期從事食品微生物資源挖掘、菌種精準鑒定和精確定量、功能菌種選育評價和發酵機制解析研究，提出中國傳統發酵食品用微生物菌種名單，并首次推薦16種中國傳統發酵食品用菌種進入IDF國際菌種名單，推進我國傳統發酵食品的國際化進程。構建傳統發酵食品用微生物資源庫，實現我國傳統傳統發酵食品用菌種資源的安全儲存、高效利用和社會共享。帶領研發團隊開展微生物技術服務和技術轉化，服務食品、藥品、化妝品、飼料、家電、水質環境等行業領域，制修訂國內外標準指南10余項，授權國家發明專利15件，發表科技論文130余篇，通過科技成果鑒定17項，獲得省部級和行業協會科技獎勵20項。

崔云龍（通訊作者）

● 國家醫用微生態工程研究中心主任、中國微生態專療委員會副主委、國家“萬人計劃”——“科技部創新創業領軍人才”、山東預防醫學會微生態分會主任委員、山東省臨床微生物腫瘤研究專家組副組長、世界華人消化雜志微生態專委會主任委員、青島東海藥業有限公司董事長。

● 曾獲“全國科技系統抗擊新冠肺炎疫情先進個人”榮譽稱號。主持完成了一類藥3個、二類藥2個、三類藥1個和四類藥3個共9個新藥的創研工作（其中生物藥7個），均已獲得新藥證書，實現了產業化。先后主持完成了微生態領域的5個863計劃項目、2個創新基金項目，1個國際合作項目和山東省重大專項等。

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