又是一年冬至，今天一起學(xué)習(xí)諾貝爾醫(yī)學(xué)獎得主Drew Weissman（2023年因在信使核糖核酸mRNA研究的突破性發(fā)現(xiàn)獲獎），和CART治療先驅(qū)Carl June均參與發(fā)表的一篇關(guān)于利用LNP體內(nèi)制備PD-1敲低CAR-T的文章。

PD1（）信號通路是腫瘤微環(huán)境中T細胞活性減弱的主要原因。雖然使用抗體阻斷來抑制PD-1通路的臨床方法已廣泛成功，但這些方法會導(dǎo)致廣泛的PD-1抑制，增加了自身免疫反應(yīng)的風(fēng)險。

這項研究報告了一種離子化脂質(zhì)納米顆粒（LNP）平臺的開發(fā)，該平臺可同時實現(xiàn)T細胞中治療性mRNA表達和RNA干擾（RNAi）介導(dǎo)的短暫基因敲低。通過這種信使RNA（mRNA）/小干擾RNA（siRNA）共遞送平臺將嵌合抗原受體（CAR）mRNA和靶向PD-1的siRNA遞送到原代人類T細胞中，可觀察到CAR表達和PD-1敲低，而沒有明顯改變T細胞的整體激活狀態(tài)。這個遞送平臺對短暫免疫基因調(diào)節(jié)有巨大潛力。

主要結(jié)果

1、離子化脂質(zhì)的合成方法、LNP制備過程、LNP的離子化特性以及LNPs的粒徑分布

a：用于生產(chǎn)離子化脂質(zhì)的SN2反應(yīng)方案。

b：通過微流體混合制備LNP的過程，顯示了四種常用的脂質(zhì)成分：離子化脂質(zhì)、輔助磷脂、膽固醇和脂質(zhì)錨定的PEG。

c：代表性的TNS（2-(p-toluidino)naphthalene-6-sulfonic acid） plot，用于證明共封裝LNPs的離子化特性（pKa在5到7之間）。

d：代表性的DLS（動態(tài)光散射）圖，描述了共封裝LNPs的大小分布。

如下圖，是一個用于同時瞬時基因表達和瞬時基因抑制的可電離脂質(zhì)納米顆粒（LNP）平臺。可以用來生成 “超級”嵌合抗原受體（CAR）T細胞，這些細胞具有瞬時的CAR表達和臨時的免疫檢查點脫敏作用，之后可以恢復(fù)到正常的T細胞表型。

2、不同配方LNPs的物理特性，以及它們共遞送mCherry mRNA和EGFP siRNA到Jurkat細胞的效果

a：展示了不同輔料組成的LNPs的z平均直徑。

b：展示了不同輔料組成的LNPs的zeta電位。

c：展示了不同輔料組成的LNPs中包裹的RNA含量。

d：展示了不同輔料組成的LNPs的RNA包裹效率。

e-h：通過流式細胞儀測量的mCherry和EGFP表達的代表性直方圖，以及EGFP+ Jurkat細胞經(jīng)mCherry mRNA和EGFP siRNA共封裝的W5 LNPs處理后的mCherry表達和相對EGFP表達。

3、mRNA和siRNA比例變化對Jurkat細胞中mCherry和EGFP表達的影響

4、原代人類T細胞中EGFP mRNA表達和PD-1 siRNA介導(dǎo)的PD-1敲低的動態(tài)變化

5、經(jīng)LNPs處理后原代人類T細胞中CAR表達的共聚焦顯微鏡圖像

6、LNPs介導(dǎo)的CAR表達和PD-1敲低，以及對T細胞激活標(biāo)記物表達的影響

a, b：代表性直方圖和條形圖，展示了經(jīng)LNPs處理后CAR表達和PD-1敲低的效果，這些LNPs包裹了CAR mRNA單獨或與PD-1靶向或亂序siRNA共封裝。

e-g：經(jīng)激活和LNPs處理后的原代人類T細胞中激活標(biāo)記物CD25、CD62L（L-選擇素）和CD69的表達。

7、在體外Jurkat細胞中篩選用于雙重RNA遞送的LNP配方

PS: Ionizable lipid（離子化脂質(zhì)）是指一類能夠在特定pH值下發(fā)生質(zhì)子化或去質(zhì)子化的脂質(zhì)。 這類脂質(zhì)具有可變的電荷狀態(tài)，通常在較酸性的環(huán)境中（如內(nèi)體或溶酶體的微環(huán)境）質(zhì)子化，從而增加其親水性。 這種性質(zhì)使LNPs能夠有效地將核酸遞送到目標(biāo)細胞中，并在細胞內(nèi)發(fā)揮作用。

在LNPs中，離子化脂質(zhì)的主要作用包括：

1. 內(nèi)體逃逸：在內(nèi)體的酸性環(huán)境中，離子化脂質(zhì)質(zhì)子化，導(dǎo)致LNPs的表面電荷和結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，這有助于LNPs從內(nèi)體中逃逸到細胞質(zhì)中。

2. 核酸釋放：離子化脂質(zhì)的質(zhì)子化也有助于核酸（如mRNA或siRNA）從LNPs中釋放到細胞質(zhì)中，從而提高基因編輯或基因沉默的效率。

3. 提高遞送效率：離子化脂質(zhì)可以改善LNPs的細胞攝取，并減少被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)（RES）的清除，從而提高藥物遞送的效率和效果。

小結(jié)

這項工作開發(fā)了一個LNP平臺，用于T細胞中同時進行基因表達和特定基因阻斷。將mRNA和siRNA共封裝在單一LNP制劑中比分別封裝和遞送更有效。

研究者們選擇了一個主要的LNP候選物，因為它在體外對Jurkat細胞具有強大的mRNA和siRNA遞送能力，并利用這種配方來抑制原代人類T細胞中PD-1的表達，觀察到強大且相當(dāng)持久的——雖然是暫時的——敲低效果，以及長期、強大的外源性mRNA表達，這兩種效果至少可以檢測到1周。

參考文獻：

Hamilton AG, Swingle KL, Joseph RA, et al. Ionizable Lipid Nanoparticles with Integrated Immune Checkpoint Inhibition for mRNA CAR T Cell Engineering. Adv Healthc Mater. 2023;12(30):e2301515. doi:10.1002/adhm.202301515.

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