本文系Food Science and Human Wellness原創編譯，歡迎分享，轉載請授權。

Abstract

在本研究中，探究了黃芪甲苷和蘆丁的組合（CAR）對恢復腸道微生物群失調、肥胖以及肥胖相關病癥的影響。將隨機選取的雄性C57BL/6J小鼠實驗性地分為5組，分別喂食正常飲食或高脂飲食（HFD），持續16周。與載體處理組（高脂飲食組）相比，CAR能夠顯著提高某些腸道微生物的豐度（阿克曼氏菌屬、乳桿菌屬、雙歧桿菌屬、羅氏菌屬、普雷沃氏菌屬），逆轉厚壁菌門與擬桿菌門的比例，并抑制肥胖小鼠體內大腸桿菌、沙門氏菌和克雷伯氏菌的生長。此外，接受CAR處理的小鼠總短鏈脂肪酸的生成量顯著增加，體質量增加量、器官重量、血清脂質譜（高密度脂蛋白除外）水平均有所降低，胰島素抵抗情況也得到緩解。與高脂飲食對照組相比，在接受CAR處理的高脂飲食小鼠中，CCAAT/增強子結合蛋白-α（C/EBP-α）、甾醇調節元件結合蛋白-1c（SREBP-1c）、過氧化物酶體增殖物激活受體-γ（PPAR-γ）、乙酰輔酶A羧化酶（ACC）、脂肪細胞蛋白2（aP2）和脂肪酸合酶（FAS）的mRNA表達均下調（P＜0.05），PPAR-γ的蛋白表達下調，而5'單磷酸腺苷激活蛋白激酶（AMPK）則發生了磷酸化。有趣的是，接受CAR處理的高脂飲食小鼠的肝臟和脂肪組織的組織結構明顯改善。總之，這些研究結果表明， CAR/辣木可能對治療胰島素抵抗和肥胖病癥有益。

Introduction

肥胖流行及非酒精性脂肪肝、2型糖尿病和心血管疾病（CVDs）在內的相關病癥，是主要的公共衛生挑戰。不良的飲食習慣、久坐不動的生活方式、日益加劇的城市化進程以及心理社會壓力，都是導致肥胖高發的因素。然而，這些因素往往難以克服，因此肥胖仍然是一個重大的健康問題。所以，探索治療肥胖及相關病癥的有效療法具有巨大的前景。目前，美國食品藥品監督管理局（FDA）和歐洲藥品管理局（EMA）批準的體質量管理藥物主要針對脂肪酶，或抑制食欲，或/和抑制脂肪堆積，但都存在相當大的副作用。

使用藥物來管理體質量的另一種方法是調節腸道微生物群。事實上，越來越多的證據表明，人類腸道微生物群和短鏈脂肪酸（SCFAs）通過調節營養攝取、能量調控以及脂肪儲存，在肥胖及相關疾病的發展過程中發揮作用。例如，在飲食誘導的肥胖大鼠和人類模型中，腸道微生物群發生顯著變化，包括厚壁菌門/擬桿菌門等主要菌門的比例以及一些細菌種類的比例都有所上升。因此，聚焦于腸道微生物群來預防和治療肥胖相關疾病，將會大有益處且不會產生任何不良影響。

自古以來，植物和草藥一直是眾多藥品和營養補充劑的潛在來源，可用于治療各種人類疾病，包括血脂異常和肥胖癥。在本研究中，從辣木葉中分離出蘆丁和黃芪甲苷，并評估了它們的聯合作用對緩解高血糖和肥胖狀況的效果。辣木富含多種維生素、礦物質和植物化學物質，包括異硫氰酸鹽、蘆丁、黃芪甲苷、兒茶素、山奈酚、槲皮素和綠原酸。蘆丁（槲皮素-3-O-蕓香糖苷）是一種黃酮醇糖苷，由槲皮素和二糖蕓香糖組成，而黃芪甲苷（山奈酚-3-O-D-葡萄糖苷）是一種具有生物活性的黃酮類化合物。據報道，蘆丁和黃芪甲苷具有心臟保護、抗炎、抗癌、抗糖尿病、抗過敏、抗氧化和抗艾滋病毒等特性。從作用機制上講，黃芪甲苷被發現可抑制絕經期間老年大鼠前列腺素的產生、血管緊張素轉化酶的活性以及卵巢顆粒細胞的凋亡。它還被認為可增加內源性雌激素和孕激素水平，并通過抑制NF-κB信號通路來減輕脂多糖誘導的炎癥。之前對辣木粗提物及其生物活性化合物的研究在抗脂肪生成方面取得了有前景的結果。因此，本研究的目的是評估黃芪甲苷和蘆丁的組合（CAR）在緩解飲食誘導的肥胖小鼠的肥胖、胰島素抵抗以及逆轉腸道微生物群失調方面的功效。我們的結果表明，CAR可能是一種用于預防和治療肥胖的潛在藥物。

Result

黃芪甲苷和蘆丁的分離與純化

黃芪甲苷和蘆丁是從辣木葉的水醇提取物部分中分離得到的，然后通過反相制備高效液相色譜法（HPLC）和超高效液相色譜法（UPLC）進行了純化、鑒定和定量分析。蘆丁的光譜細節及其結構如圖1所示。

圖1 蘆丁的液相色譜-質譜圖譜及結構

CAR對體質量和食物攝入量的影響

為了觀察CAR對肥胖的影響，給高脂飲食（HFD）誘導的肥胖小鼠（經口灌胃）給予劑量為20或40 mg/kg bw的CAR，將奧利司他（5 mg/kg bw）用作抗肥胖活性的陽性對照藥物。如圖2所示，與正常飲食喂養的組相比，喂食高脂飲食的小鼠體質量隨著時間顯著且穩定地增加（增加了53.74%）。然而，口服CAR可使高脂飲食喂養的小鼠體質量增加量顯著且呈劑量依賴性地減少（P＜0.05）。在CAR劑量為40毫克/千克時觀察到體質量增加量的最大減少，且這與喂食高脂飲食并接受奧利司他治療的組相近（圖2A和B）。然而，在CAR處理組的食物攝入量方面未觀察到顯著差異（圖2C），這表明CAR可以在不影響食物攝入量的情況下減少小鼠的體質量增加量。

圖2 辣木CAR對C57BL/6J小鼠體質量的影響

CAR對胰島素抵抗和葡萄糖穩態的影響

為了研究CAR是否能減輕高脂飲食喂養小鼠的葡萄糖不耐受和胰島素抵抗，在給小鼠用CAR處理第4周和第5周后，進行了口服葡萄糖耐量試驗（OGTT）和胰島素耐量試驗（ITT）。高脂飲食對照組的葡萄糖和胰島素水平明顯高于正常飲食喂養組。然而，與未處理的高脂飲食組相比，劑量為40 mg/kg bw的CAR組顯著改善了受損的葡萄糖和胰島素耐受性（P＜0.05）（圖3A-D）。此外，高脂飲食對照組未觀察到胰島素的降血糖作用（與正常對照組相反），而CAR處理組在注射胰島素后血糖明顯降低。另外，在OGTT和ITT試驗中，接受CAR處理的小鼠均表現出劑量和時間依賴性反應。與這些結果一致的是，圖3E展示了高脂飲食對照組和肥胖治療組小鼠脂肪組織中磷酸化5'-單磷酸腺苷激活蛋白激酶（p-AMPK）和過氧化物酶體增殖物激活受體-γ（PPAR-γ）的蛋白表達水平。用CAR處理可通過其磷酸化來激活AMPK，然而，與高脂飲食對照組小鼠相比，在劑量為20和40 mg/kg bw的CAR處理下，高脂飲食喂養的肥胖小鼠的PPAR-γ表達下調。這些發現表明，CAR在維持能量穩態的同時，還能減少脂肪組織中的脂肪生成。

圖3 CAR對高脂飲食喂養小鼠的葡萄糖不耐受和胰島素抵抗的影響

CAR對脂肪組織和肝臟組織病理學的影響

對用蘇木精和伊紅染色的肝臟和脂肪組織切片，通過光學顯微鏡在40倍放大倍數下進行觀察。喂食高脂飲食的對照組的肝臟組織切片顯示出脂滴積累、炎性細胞存在、細胞核缺失以及肝細胞嚴重腫脹的情況。與正常對照組相比，高脂飲食對照組小鼠的脂肪組織切片顯示出脂肪細胞增大，有脂滴儲存且細胞邊界塌陷。給予CAR（40 mg/kg bw）顯著減小了脂肪細胞的大小和脂類儲存量，這揭示了其在維持脂肪組織結構完整性方面的抗肥胖作用（圖4）。關于肝臟組織，用CAR（40 mg/kg bw）處理的高脂飲食喂養組顯示出脂質積累減少，肝臟組織結構得到改善，這表明CAR處理起到了保護和恢復作用（圖5）

圖4 CAR對脂肪組織的影響

圖5 CAR對肝組織的影響

CAR對與脂肪生成和脂質生成相關基因mRNA表達的影響

為了在基因水平上評估CAR的作用，使用qRT-PCR測量了與脂肪生成和脂質生成相關的關鍵基因的mRNA表達水平。如圖6A-F所示，給予CAR顯著且呈劑量依賴性地下調了乙酰輔酶A羧化酶（ACC）、脂肪酸合成酶（FAS）、甾醇調節元件結合蛋白-1c（SREBP-1c）、脂肪細胞脂肪酸結合蛋白（aP2）、CCAAT/增強子結合蛋白-α（C/EBP-α）和PPAR-γ的表達，并且在劑量為40mg/kg bw時觀察到的作用最為顯著。因此，CAR可以通過調節上述信號分子和轉錄因子，抑制高脂飲食喂養小鼠的脂肪生成和脂質生成。

圖6 CAR對脂肪形成和脂質代謝相關關鍵基因mRNA表達的影響

CAR對腸道微生物群和短鏈脂肪酸的影響

此外，在門和屬的水平上評估了腸道微生物群的變化。在喂食正常飲食的小鼠、喂食高脂飲食的小鼠以及接受CAR處理的小鼠之間，觀察到了腸道微生物群組成和豐度的明顯差異（圖7A和B）。在喂食高脂飲食的對照組中，觀察到厚壁菌門水平升高，而擬桿菌門水平降低，而接受CAR處理的高脂飲食組則顯示出厚壁菌門水平降低，擬桿菌門水平升高（P＜0.001）。此外，CAR在屬的水平上增加了有益細菌的豐度，如阿克曼氏菌屬（Akkermansia）、普雷沃氏菌屬（Prevotella）和羅氏菌屬（Roseburia），但減少了革蘭氏陰性有害細菌，如大腸桿菌（E. coli）、腸桿菌屬（Enterobacter）、沙門氏菌屬（Salmonella）和克雷伯氏菌屬（Klebsiella）。然而，與喂食高脂飲食的對照小鼠相比，對革蘭氏陽性的乳酸桿菌屬（Lactobacillus）和雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）的豐度沒有觀察到太大影響（圖7B）。對盲腸內容物的分析表明，喂食高脂飲食的組中，乙酸、丙酸、丁酸和乳酸等SCFAs的水平下降，而20和40 mg/kg bw的CAR處理都能使這些短鏈脂肪酸水平恢復（圖8）。

圖7 CAR對腸道微生物紊亂的影響

圖8 CAR對SCFAs的影響

Conclusion

綜上所述，從辣木葉中分離出的CAR已顯示出對腸道微生物群失調的修復潛力。此外，CAR可增加SCFAs的產生，并通過調節PPAR-γ和AMPK介導的信號通路，對高脂飲食誘導的肥胖小鼠模型表現出潛在的抗肥胖和胰島素增敏作用。因此，CAR可能是一種潛在的天然物質，對預防和治療肥胖相關病癥有益。

Astragalin and rutin restore gut microbiota dysbiosis, alleviate obesity and insulin resistance in high-fat diet-fed C57BL/6J mice

Muni Swamy Ganjayia,b, Karunakaran Reddy Sankarana, Balaji Merigaa,*, Ruchika Bhatiac, Shikha Sharmac, Kanthi Kiran Kondepudic

a Department of Biochemistry, Sri Venkateswara University, Tirupati 517502, India

b Department of Biomedical Sciences, Heritage College of Osteopathic Medicine, Ohio University, Athens 45701, United States

c Food and Nutrition Biotechnology Division, National Agri-Food Biotechnology Institute, SAS Nagar, Punjab 140306, India

*Corresponding author.

Abstract

In the present study we investigated the impact of the combination of astragalin and rutin (CAR) on restoring gut-microbial dysbiosis and obesity and obesity related disorders. Randomized male C57BL/6J mice were experimentally divided into 5 groups and fed either a normal diet or a high-fat diet (HFD) for 16 weeks. Compared to vehicle treated group (HFD group), CAR could substantially improve selected gut microbiota abundance (Akkermansia, Lactobacillus, Bifidobacteria, Roseburia, Prevotella), reversed the Firmicutes/Bacteroidetes proportions, and inhibited the growth of Escherichia coli, Salmonella, and Klebsiella in obese mice. In addition, CAR-treated mice showed significantly increased total short-chain fatty acid production, reduced body weight gain, organs’ weights, serum lipid profile (except HDL) and insulin resistance. The mRNA expressions of CCAAT/enhancer binding protein-α (C/EBP-α), sterol regulatory element-binding protein-1c (SREBP-1c), peroxisome proliferator-activated receptor-γ (PPAR-γ), acetyl-CoA carboxylase (ACC), adipocyte protein 2 (aP2), and fatty acid synthase (FAS) were downregulated (P < 0.05) and the protein expression of PPAR-γ was downregulated while adenosine 5’ monophosphate-activated protein kinase (AMPK) was phosphorylated in CAR-treated HFD-fed mice compared to the HFD control group. Interestingly, CAR-treated HFD-fed mice showed significantly improved tissue architecture in the liver and fatty tissues. In conclusion, the findings suggest that CAR/Moringa oleifera may be beneficial in the treatment of insulin resistance and obesity disorders.

Reference:

GANJAYI M S, SANKARAN K R, MERIGA B, et al. Astragalin and rutin restore gut microbiota dysbiosis, alleviate obesity and insulin resistance in high-fat diet-fed C57BL/6J mice[J]. Food Science and Human Wellness, 2024, 13(6): 3256-3265. DOI:10.26599/FSHW.2023.9250012.

翻譯：王立磊（實習）

編輯：梁安琪；責任編輯：孫勇

封面圖片：圖蟲創意

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