撰文丨王聰

編輯丨王多魚

排版丨水成文

一直以來，如何將整個基因高效且精準地整合到特定基因組位點，是基因組編輯領域的一個長期存在的難題。盡管現有的基因編輯技術可以修復大多數致病基因突變，然而，許多疾病的遺傳多樣性（例如，ABCA4 基因的 500 多種突變類型會導致Stargardt病，PAH 基因的 1000 多種突變類型會導致苯丙酮尿癥，而 CFTR 基因的 2000 多種突變類型會導致囊性纖維化）導致我們需要設計多種針對特定突變的不同基因編輯療法，這嚴重限制了能夠受益于基因編輯療法的患者數量。直接將整個基因整合到基因組中的靶向整合技術，可為功能缺失突變的遺傳疾病提供一種不依賴具體突變類型的通用療法，此外，該技術還可用于癌癥免疫療法、轉基因細胞和動物模型構建，以及代謝工程等領域。

2019 年 6 月，張鋒團隊以及哥倫比亞大學的Samuel Sternberg團隊各自獨立發現了CRISPR 相關轉座酶（CAST），CAST 是一類 RNA 引導的轉座酶，能夠以高度特異的方式將大片段 DNA 移動到新的位置。而且不會造成 DNA 雙鏈斷裂，從而避免了可能產生的不良編輯副產物【1、2】。

CAST 的發現為基因的精準整合奠定了基礎，然而，其在人類細胞中的編輯效率不足0.1%，這么低的效率，顯然無法實際應用。

2025 年 5 月 15 日，劉如謙團隊與Samuel Sternberg團隊合作，在國際頂尖學術期刊Science上發表了題為：Programmable gene insertion in human cells with a laboratory-evolved CRISPR-associated transposase 的研究論文【3】。

該研究利用噬菌體輔助連續進化（PACE） 技術來提高CRISPR 相關轉座酶（CAST）的活性，成功進化出了活性提高數百倍的EvoCAST，能夠在人類細胞中實現高效且精準的大片段基因插入，效率相比天然 CAST 提高了 420 倍。EvoCAST 可支持超過 10kb 的超大 DNA 片段整合，并介導了多種治療性有效載荷在與疾病相關的基因組位點的整合（包括安全港位點、癌癥免疫治療工程位點，以及功能缺失遺傳疾病相關基因位點）。此外，EvoCAST 還可在多種人類細胞類型（例如原代人類成纖維細胞）中進行靶向整合，并展現出高產物純度：未檢測到插入或缺失突變（indels），主要為單向插入，整合精度達單堿基對水平，且脫靶整合頻率極低。

總的來說，這項研究為 CAST 的實驗室進化奠定了基礎，并推進了一種在活體系統中實現可編程基因整合的通用系統。

為了提高 CAST 系統的效率，Samuel Sternberg團隊與劉如謙團隊合作，利用劉如謙團隊于 2011 年開發的噬菌體輔助連續進化（PACE）技術，這是一種蛋白質定向進化方法，簡單來說，PACE 技術模擬了物競天擇的自然進化篩選過程：首先需要培養多種快速進化的噬菌體，同時對其進行不斷稀釋，而只有那些表達具有特定理想特征的蛋白變體的噬菌體才能通過比稀釋速度更快的復制速度存活下來。

經過數百輪的進化，研究團隊成功得到了 CAST 轉座酶蛋白 TnsB 的一個進化變體，其在人類細胞中的整合活性提高了 200 多倍。進化后的 TnsB 包含 10 個活性增強突變，這些突變可能調節了其與其他 CAST 組件的多種不同相互作用。值得注意的是，進化后的 TnsB 無需共遞送具有細胞毒性的細菌 CAST 輔助蛋白 ClpX 的情況下即可在人類細胞中實現高效整合。研究團隊進一步將進化后的 TnsB 變體與其他通過 PACE 進化和理性工程改造的 CAST 組件相結合，得到了EvoCAST系統。

進一步驗證實驗顯示，EvoCAST 在人類細胞的 14 個基因組靶點上實現了10%-30%的基因整合效率，相比天然 CAST 系統，效率平均提高了420 倍。EvoCAST 支持>10kb的超大片段 DNA 整合，并介導了多種治療性有效載荷在與疾病相關的基因組位點的整合（包括安全港位點、癌癥免疫治療工程位點，以及功能缺失遺傳疾病相關基因位點）。此外，EvoCAST 還可在多種人類細胞類型（例如原代人類成纖維細胞）中進行靶向整合，并展現出高產物純度：未檢測到插入或缺失突變（indels），主要為單向插入，整合精度達單堿基對水平，且脫靶整合頻率極低。

PACE 進化而來的 CAST（EvoCAST），可在人類細胞中實現高效、可編程的基因整合

值得一提的是，2024 年 6 月，劉如謙團隊利用 PACE 技術對絲氨酸整合酶Bxb1 進行了數百輪進化，開發出了eePASSIGE系統【4】，可實現 10kb 的超大片段 DNA 的高效整合（效率可達 35%） 。

劉如謙表示，EvoCAST與eePASSIGE分別基于不同的整合機制，二者具有互補優勢，eePASSIGE 的效率更高，但 evoCAST 的編輯純度更高。此外，eePASSIGE 借助先導編輯器和重組酶，需要兩步實現基因整合，而 evoCAST 只需一步，更為簡單。

總的來說，這項研究確立了 CAST 作為一種強大的平臺技術，能夠高效地在人類細胞中實現 RNA 引導的基因整合。evoCAST 的優勢包括其簡單的可編程性、一步整合機制以及避免 DNA 雙鏈斷裂，使其非常適合生命科學研究以及疾病治療中的許多應用，包括通過一種通用基因編輯療法解決遺傳多樣化的患者群體。

更重要的是，該研究展示了如何通過實驗室進化將天然存在的系統轉化為強大的治療工具，為改進其他天然存在的 CAST 系統以實現高效基因編輯提供了新策略。

論文鏈接：

https://www.science.org/doi/10.1126/science.aax9181

https://www.nature.com/articles/s41586-019-1323-z

https://www.science.org/doi/10.1126/science.adt5199

https://www.nature.com/articles/s41551-024-01227-1