【NO.1】ADC質量屬性

任何生物制品工藝開發的主要目標都是可重復的工藝，生產出符合所有質量屬性驗收標準的高質量產品。對于非ADC生物制劑，這包括先前觀察到會影響產品功效或安全性的許多屬性，包括產品ag基因、片段、電荷異構體、氧化變體、雜質（宿主細胞蛋白、DNA等）、產品濃度、效力等。其他質量屬性對于ADC也很重要，例如載藥量和一致性以及無殘留（未偶聯）藥物的水平。

ADC偶聯工藝的開發重點通常集中在表40.1中描述的質量屬性上，因為這些屬性在偶聯過程中受到直接影響，并且通常是ADC最難控制的。DAR可以說是ADC最重要的屬性，因為它直接影響安全性和有效性，因此應控制在適當窄的規格以確保產品的一致性。對于不使用特定位點共軛的ADC平臺來說，實現嚴格的DAR控制尤其具有挑戰性。還必須控制DAR物種分布，因為可以達到相同的平均值，但不同的亞群包含更高和更低的藥物載量。游離（未偶聯）藥物也是一個關鍵屬性，因為這種雜質不會選擇性地遞送至治療靶點，因此會在不增加功效的情況下導致全身毒性。大小變體（包括聚集體和片段）是ADC和非ADC生物制劑的重要產品變體，但由于溶劑的使用和許多所用小分子藥物的疏水性，在偶聯過程中控制起來尤其困難。最后，在ADC制造過程中可以加入升高的溶劑水平以溶解藥物，因此將殘留溶劑去除到可接受的水平通常是ADC工藝的開發重點。

表40.1關鍵ADC產品質量屬性摘要，這些屬性是許多ADC平臺和制造工藝的主要開發重點

【NO.2】ADC工藝概述

ADC的偶聯通常在專門建造的設施中進行，用于高效化合物，利用在單獨工藝中制備的抗體和藥物中間體（即前體）（圖40.3）。這使得現有的制造設施可用于生產抗體中間體。分離抗體和ADC制造過程增加了供應鏈的長度和復雜性，但具有明顯的優勢，即在偶聯過程之前控制中間體的質量。這可以防止由于抗體或藥物批次質量較低而導致偶聯過程中可能發生的潛在失敗，從而避免與偶聯原材料損失、植物時間或延遲時間表相關的重大成本。這種方法的其他好處包括它簡化了ADC生產工藝和控制系統，并提供了將偶聯批次大小與抗體生產規模分離的靈活性。

圖40.3一種典型的ADC產品供應鏈，其中抗體和小分子藥物作為中間體生產和釋放，然后在ADC原料藥生產過程中偶聯。

或者，可以在單個端到端生產設施中結合抗體中間體和偶聯工藝。該策略可以通過避免在純化和偶聯過程中復制某些單元作（例如UF/DF）來減少所需的制造作總數。在偶聯前避免長期儲存抗體中間體也有好處。然而，端到端ADC工藝需要匹配的抗體中間體和偶聯量表，這在開發的早期階段將具有挑戰性，尤其是在藥物供不應求的情況下。此外，由于該產品的高效性，大多數現有生物制劑生產設施都無法進行端到端ADC制造。隨著ADC領域的成熟，端到端抗體生產和偶聯工藝的開發可能會增加，并且有更多的開發和商業化生產項目來證明對這種方法的投資是合理的。

2.1抗體中間體

抗體中間體的質量顯著影響最終ADC的產品質量，既通過直接賦予ADC一些屬性（例如，在上游工藝中控制的宿主細胞蛋白和DNA等雜質，因為它們通常不受偶聯過程的影響）和影響偶聯反應的性能。因此，優選使用高純度和特征良好的抗體。

抗體中間體通常經過純化并釋放到與傳統（非ADC）抗體療法相當的規格。對于用于下游偶聯的抗體中間體，更廣泛的釋放標準可能適用于某些不會顯著影響偶聯反應的屬性。例如，抗體中間體的抗體濃度或pH值的可接受范圍可以更寬，因為這些屬性可以在偶聯過程中進一步調整。相反，用于下游偶聯的抗體中間體可能需要對某些屬性有更嚴格的驗收標準。例如，優選抗體中間體中聚集體的狹義接受標準，因為在偶聯過程中可能會形成額外的聚集體。如果抗體已經作為具有更廣泛接受標準的非偶聯療法生產，則可能需要進行批次選擇，以選擇能夠確保可接受的ADC產品質量的批次。

嚴格控制抗體中間體與抗體偶聯位點相關的屬性尤為重要。如果抗體中間體制造工藝了解并嚴格控制抗體中間體變異性的潛在影響，則可以實現更簡單、更穩健的偶聯過程。例如，三硫鍵的存在已被證明會改變制備鏈間半胱氨酸ADC時所需的反應化學計量。同樣，抗體中間體中不同水平的游離硫醇會導致該ADC平臺形式的DAR變異性。可以想象，C端賴氨酸水平或糖基化模式的變異性可能會對其他ADC平臺產生類似的影響。

在開發過程中還必須考慮抗體中間體的配方。如果可能，應根據與預期ADC平臺的兼容性來選擇抗體制劑賦形劑，例如，如果ADC過程的第一步是賴氨酸（即伯胺）定向偶聯化學，則避免使用含胺的緩沖液系統。

2.2小分子藥物中間體

由于ADC中使用的強效藥物的性質多種多樣，這些分子的制造工藝存在顯著差異，包括使用全合成和半合成路線。無論采用何種生產資料，藥物都必須是可合成量較多且純度高的。此外，藥物必須在中間儲存條件下保持穩定，直到在偶聯過程中使用。

盡管小分子藥物在技術上被歸類為ADC偶聯過程中的中間體，但它通常被認為是ADC的“先導化合物”，因為它主要負責產品的功效和毒性。因此，藥物中間體的工藝控制和釋放規范與小分子原料藥相當。與傳統的小分子一樣，純度/雜質曲線是藥物中間體最重要的質量屬性。然而，小分子中間體中的雜質可以根據共軛中使用的反應官能團的存在與否進一步分類為“可共軛”或“非共軛”。將藥物中間體中的可共軛雜質控制在可接受的水平是至關重要的，因為在ADC偶聯后，它極難定量且幾乎不可能去除含有可偶聯雜質的產物變體。

與抗體中間體類似，一些對小分子API至關重要的質量屬性對于小分子藥物中間體并不重要，因為在ADC偶聯過程中會進行額外的加工。例如，ADC偶聯工藝通常利用有機溶劑溶解藥物中間體，因此包括具有高溶劑去除能力的工藝步驟（例如，切向流過濾）。因此，與API可接受的溶劑相比，小分子中間體中可以容忍更高水平的殘留溶劑。同樣，如果在偶聯反應步驟后證明清除率一致，則非偶聯雜質水平升高可能是可以接受的。最后，小分子中間體的物理屬性通常不如傳統API重要，因為偶聯過程的第一步是將中間體溶解在有機溶劑中。只要藥物中間體在所選溶劑中充分溶解，那么多晶型物、粒徑和溶解時間就不太可能成為關鍵的材料屬性。

【NO.3】ADC偶聯工藝

ADC偶聯過程相對獨特，因為它涉及處理大分子生物藥物和小分子藥物。如上所述，這些通常作為ADC偶聯過程的表征良好的中間體提供，只需要相對簡單的化學成分即可形成ADC。該工藝旨在控制共軛反應，并將所有殘留的工藝中間體和產生的雜質去除到可接受的水平。盡管存在用于生產ADC的ADC平臺和偶聯化學物質，但制造過程可以分為三個不同的階段，這些階段在大多數ADC平臺上都是一致的（參見上圖40.3）：

第1階段：抗體功能化：此階段在不同ADC平臺之間的差異最大。通過為每個抗體產生所需數量的反應位點來制備抗體以進行偶聯，最常見的方法是還原、還原/再氧化或使用雙功能接頭進行修飾。為了實現下游偶聯反應所需的條件，還可以執行額外的調整步驟，可能包括改變池的濃度、pH值、溫度、溶劑水平或緩沖液組成。

第2階段：偶聯反應將小分子藥物溶解在有機溶劑中，并添加到抗體溶液中以形成ADC。通常，將藥物過量添加到抗體反應性基團中，以確保完全偶聯。根據偶聯反應的化學性質，可以在偶聯反應后進行淬滅步驟。

第3階段：純化和制劑對ADC進行純化，以去除偶聯后可能存在的過量藥物、工藝相關雜質和產品變體。超濾和滲濾（UF/DF）通常用于在偶聯后去除小分子雜質，也是配制ADC原料藥的標準單元作。根據抗體和藥物的分子特性，在UF/DF之前可能還需要進行額外的純化。

ADC制造過程每個階段所需的復雜性和步驟數可能會因ADC分子的設計和偶聯反應化學而有很大差異。以下部分詳細介紹了每個階段中工藝開發和制造的具體注意事項。

第1階段：抗體功能化

在ADC制造過程的“功能化”階段，抗體上會產生反應基團，隨后可以直接與藥物（或與聯合連接子-藥物）偶聯形成ADC。對于許多ADC工藝，抗體功能化步驟是制造過程中最關鍵和最敏感的步驟，因為它們直接控制藥物附著的數量和位點。因此，實現目標DAR的過程魯棒性是這些步驟的重要開發重點。

抗體功能化步驟因ADC的設計而異，但通常包括在抗體上產生游離硫醇的還原反應或添加異雙功能連接子的修飾反應。在抗體功能化過程中，可能還需要緩沖液交換步驟，以便在反應步驟之前去除不相容的buffer物種或過量的試劑。對于某些ADC平臺（例如，與非天然氨基酸偶聯），抗體已經功能化以進行偶聯，因此抗體功能化只需要調整到所需的反應條件。

圖40.4本章重點的三種ADC平臺所需的典型抗體功能化步驟的比較

圖40.4比較了本章重點介紹的三種ADC平臺的抗體功能化階段。對于賴氨酸定向ADC，加入異雙功能交聯劑，如SMCC（琥珀酰亞胺基4-（N-馬來酰亞胺基）環己烷-1-羧酸酯）、SPDB（N-琥珀酰亞胺基-4-（2-吡啶基二硫代）丁酸酯）或SPP（N-琥珀酰亞胺基-4-（2-吡啶基二硫代）戊酸酯）與抗體的表面暴露賴氨酸反應。在許多情況下，在修飾反應之前，抗體通過UF/DF交換到新的緩沖液中，以提供對修飾反應條件的額外控制，并去除與接頭化學不相容的緩沖液組分。在用交聯劑修飾抗體后，需要額外的緩沖液交換步驟，以在偶聯之前去除多余的交聯劑。對于鏈間半胱氨酸ADC，添加有限量的還原劑以減少所需的二硫鍵數量。還原后，在偶聯之前通常不需要緩沖液交換步驟，因此還原的抗體可以立即準備好進行偶聯。最后，對于THIOMAB藥物偶聯物平臺，首先使用顯著過量的還原劑完全還原THIOMAB抗體，以去除工程半胱氨酸中的所有半胱氨酸和谷胱甘肽“帽”，這也減少了部分或全部鏈間二硫鍵。然后使用UF/DF將還原的抗體進行緩沖液交換，以去除多余的還原劑和游離的“帽”。然后添加脫氫抗壞血酸（dHAA）等氧化劑以促進鏈間二硫鍵的重新形成，從而使工程半胱氨酸成為唯一剩余的用于偶聯的游離硫醇。我們發現，只要避免變性條件（例如高溫），抗體亞基在整個還原和氧化步驟中保持組裝狀態，因此該過程不會產生高水平的片段。只要氧化劑（例如dHAA）與偶聯反應化學和藥物相容，就不需要在偶聯前更換緩沖液。

抗體功能化過程中反應步驟所需的工藝開發和優化高度依賴于所使用的ADC平臺。通常在開發過程中研究反應pH值、溫度、抗體濃度、反應時間和試劑等量，但過程對這些參數變化的敏感性在ADC平臺之間差異很大。例如，由于競爭副反應對功能化抗體產量的影響，使用異源功能連接子SMCC對抗體進行賴氨酸定向修飾對反應條件極為敏感。這些競爭性副反應包括接頭上NHS官能團的水解，阻止接頭與抗體連接，以及接頭的馬來酰亞胺官能團與抗體氨基酸側鏈之間發生的交聯反應（圖40.5）。由于接頭與抗體的修飾反應速率以及競爭性副反應的速率都在很大程度上取決于反應的pH、溫度和抗體濃度，這些參數必須經過優化并嚴格控制，以實現一致的接頭數量，并最終為每個抗體添加的藥物數量一致。

圖40.5用于一些賴氨酸定向藥物偶聯物中的異雙功能連接子SMCC。顯示了目標和潛在的副反應，突出了在工藝開發過程中面臨的挑戰，即建立工藝靶標和控制范圍以實現所需偶聯物的可重復性。

相比之下，用于偶聯ADC的其他一些反應化學試劑對反應條件的變化不太敏感。例如，對于鏈間半胱氨酸ADC，生成的游離硫醇數量直接取決于還原劑的使用量，并且在典型制造過程的過程控制能力中，與其他過程參數（如反應pH值、時間和溫度）相當無關。因此，鏈間半胱氨酸ADC的一個重要開發重點是確定所需的還原劑量并確保在制造過程中準確添加，但在還原過程中較少關注其他工藝參數。同樣，THIOMAB抗體的設計為抗體功能化步驟提供了一定程度的固有穩定性，因為添加過量的試劑以完全還原然后完全再氧化抗體，即使工藝參數存在一些變化，也能產生一致數量的偶聯位點。

在抗體功能化步驟中獲得的產量通常也取決于所選的ADC平臺，這主要是由緩沖液更換和過濾步驟中的產物損失驅動的。因此，相對簡單的鏈間半胱氨酸定向偶聯過程預計具有95%-100%的上游產率，因為在反應步驟中預計不會產生產物損失。相比之下，對于需要1到2次緩沖液交換和額外過濾（轉移）的更復雜的平臺，預計產量會降低85%–95%。

盡管抗體功能化步驟的工藝各不相同，但多個ADC平臺仍遇到了一致的挑戰。下面提供了開發和擴大抗體功能化步驟的一些典型挑戰和注意事項。

試劑添加的準確性

在ADC制造過程中，試劑通常以預定義的摩爾比（即摩爾當量）與抗體添加，在某些情況下，這些添加的準確性對于實現所需的DAR至關重要。例如，在鏈間半胱氨酸ADC工藝中，產生的游離硫醇的可用數量與添加的還原劑成正比。因此，還原劑添加中5%的誤差轉化為DAR的變化約5%。因此，在全面生產過程中盡可能準確地添加試劑至關重要。

考慮到基于摩爾比的添加的制造變異性的眾多潛在來源，包括抗體和試劑量的潛在誤差，在試劑添加中達到所需的準確度水平可能具有挑戰性。可變性的潛在來源及其對典型全規模過程的可能貢獻程度估計如下：

●抗體溶液，濃度測量（±5%）

●抗體溶液，添加體積（±1%）

●還原劑儲備液制備，稱量固體質量（±1%）

●還原劑儲備液制備，所用溶劑體積（±1%）

●還原反應，加入反應體積（±1%）

鑒于后期開發ADC的DAR規格可能窄至±10%，試劑添加過程中的綜合誤差可能會將DAR推向故障極限。這尤其成問題，因為其他工藝變異性來源也會影響DAR，包括試劑純度和反應步驟的參數。因此，需要準確添加試劑，以最大限度地提高工藝穩健性。

有許多制造策略可能會提高ADC制造中試劑添加的準確性，包括：

●在QC實驗室中使用重量法蛋白質濃度測量代替現場測量

●根據溶液質量而不是體積進行添加（取決于生產規模和所使用的設備）

●最大限度地減少傳輸管線損失并盡可能考慮損失

●在轉移后進行緩沖液追蹤

●添加后測量容器重量以確認轉移的完整性

●在基于溶液制備過程中考慮試劑純度根據試劑分析證書上給出的純度

●如果過程允許，降低試劑溶液的濃度，這會增加添加物的體積（和準確性）。

通過實施這些策略以盡可能嚴格地控制試劑添加的各個方面，可以常規添加的目標摩爾比的幾個百分比以內的試劑。

與抗體功能化步驟的許多方面一樣，穩健生產所需的試劑添加精度取決于所選的ADC平臺。賴氨酸定向反應化學要求試劑添加的準確性最高，因為DAR與添加的試劑量直接相關，并且修飾反應受反應條件的嚴重影響，因此出錯的可能性較小。相比之下，THIOMAB偶聯過程不會受到試劑添加量微小變化的顯著影響，因為添加高摩爾過量是為了推動反應完成。因此，添加試劑量的微小變化不會影響DAR，從而實現本質上更穩定的全面生產。不同ADC平臺的工藝控制要求的這種差異凸顯了ADC分子的設計如何定義工藝開發和放大過程中遇到的一些挑戰。

產品異質性控制

對于某些ADC，最終產物是抗體的異質混合物，其中包含每個分子偶聯的藥物數量（又稱DAR物種組成）和藥物附著位點的進一步變異性（又稱位置異構體）。這種水平的產品異質性對于某些ADC平臺是預期的，并且已被證明是可接受的；ADCETRIS和KADCYLA本質上都是異質性的。然而，ADC亞群之間的安全性、有效性和PK特征可能有所不同。因此，從臨床前材料到商業材料，在每批材料中實現物種的一致分布非常重要，包括DAR物種組成和位置異構體。ADC異質性最終在工藝的抗體功能化階段得到控制，因為這些步驟定義了抗體上偶聯位點的數量和位置。

賴氨酸定向ADC具有顯著的分子異質性，因為抗體上有40+賴氨酸可用于偶聯。結果是ADC包含0到9種藥物，每種抗體在多個潛在位點偶聯，從而在最終產品中增加數百萬個獨特物種。然而，盡管存在這種程度的固有異質性，偶聯產物仍可能具有很高的批次間一致性。先前已經證明，對于KADCYLA，DAR形式的組成類似于以平均DAR為中心的泊松分布，使用一系列工藝條件和規模在KADCYLA制備之間獲得一致的組成。

圖40.6在相似的加工條件下，使用七種不同的抗體制備的鏈間半胱氨酸ADC的近似DAR物種組成和位置異構體水平，目標平均DAR為3.5

使用IgG1抗體制備的鏈間半胱氨酸ADC主要包含每個抗體連接的0、2、4、6或8種藥物，具體取決于四種鏈間二硫鍵中的多少被還原（圖40.6）。作為異質性的第二級，產生位置異構體取決于還原發生在鉸鏈區域還是在Fab區域。先前已經證明，在受控還原條件下，Fab區鏈間半胱氨酸相對于鉸鏈區鏈間半胱氨酸優先還原。這提高了圖40.6中總結的ADC的近似DAR物種組成，平均DAR為3.5，該指標已被證明在該平臺內的不同抗體中相對一致。

圖40.7使用一系列參數生產的鏈間半胱氨酸藥物偶聯物的DAR物種組成，如表40.2所述

上述產品異質性數據是使用僅在目標條件下運行的偶聯過程產生的。我們進一步評估了DAR的種類組成和位置同分異構體水平在一個給定抗體的大范圍工藝參數（表40.2）。)。圖40.7顯示了DAR物種組成與平均DAR的函數關系，該結果是對改變反應pH、溫度、持續時間、抗體濃度和還原劑量的工藝條件進行多變量研究的結果。將這些結果與從僅改變還原劑摩爾過量產生的偶聯物中獲得的對照數據集進行比較（實線，圖40.7）。正如預期的那樣，具有較高平均DAR的偶聯物富含高DAR形式（DAR4、6和8），而具有較低平均DAR的偶聯物含有高水平的低DAR形式（DAR0和2）。值得注意的是，DAR物種組成主要由平均DAR定義，考慮到所研究的廣泛工藝參數范圍，這是顯著的。對于任何DAR形式，實驗結果與預測組成（實線）之間觀察到的最大差異為3%，表明控制平均DAR也會影響DAR物種組成。還使用先前發表的方法測定了這些樣品的位置異構體[51]，這表明在如此廣泛的工藝條件下，位置異構體與平均DAR相似（數據未顯示）。每個DAR形式的實驗確定水平與基于目標反應條件下共軛的預測水平之間的最大差異為7%。這些結果表明，對于鏈間半胱氨酸ADC，實現一致平均DAR的過程控制范圍也將確保DAR物質組成和位置異構體控制在一致的水平。

表40.2多變量研究中測試的工藝參數范圍，用于評估工藝參數變化對所得ADC的DAR物質組成（圖40.7）和位置異構體水平的影響

與上述來自固有異質性ADC的示例相比，許多定點導向的ADC平臺是天然同質的，因為偶聯主要針對目標位點。因此，由于DAR物種組成和位置異構體的一致性被設計到產品中，因此可以簡化工藝開發和放大。獲得均一ADC產物的另一種策略是在偶聯后純化所需的DAR形式。然而，由于會產生大量的產量損失，以及在制備規模上實現必要分離度的挑戰，這種策略對于常規生產來說可能不可行。

工藝變異性的其他潛在來源

抗體功能化步驟的另一個考慮因素是進料原材料（包括抗體和試劑）的變異性對反應步驟的影響程度。如果反應化學計量對產品質量至關重要，則試劑純度會對工藝產生直接影響，在這種情況下，試劑儲備液的制備應補償試劑的純度。由于生物制品的大小和固有的變異性，抗體對反應步驟的潛在影響可能更難以預測。因此，在開發過程中需要付出大量努力來了解抗體中間體產生的工藝變異性的潛在來源，并在生產過程中對相關屬性建立充分的控制。

一個這樣的例子是抗體三硫化物對鏈間半胱氨酸ADC生產過程中使用的部分還原反應的影響。三硫化物是抗體中天然存在的產物變體，在細胞培養過程中可以產生不同水平，具體取決于培養條件。抗體中間體中的三硫化物水平可以顯著影響鏈間半胱氨酸ADC的ADC產生，因為需要兩摩爾當量的還原劑（例如，三（2-羧乙基）膦（TCEP）或二硫蘇糖醇（DTT））來完全還原三硫化物鍵并產生兩個游離硫醇進行共軛，而完全還原二硫鍵需要一個當量的還原劑。因此，對于含有三硫化物的抗體，產生偶聯所需游離硫醇數量的總體反應化學計量會發生變化。對于圖40.8中給出的示例，由于存在~7%的三硫化物，使用預定量的TCEP作為還原劑時，使用抗體批次#3與抗體批次#1相比，DAR將降低約0.6。因此，抗體引入的工藝變異性可能足以導致DAR不符合釋放規范，具體取決于三硫化物變異性的大小。

圖40.8每個點代表一個單獨的還原和共軛實驗

一旦了解了中間體工藝變異性的潛在來源，就可以采取各種策略來確保穩健性。在上述三硫化物水平可變的例子中，額外的細胞培養開發可能會產生持續的三硫化物水平，或者可以調整每個抗體批次中使用的還原劑量，以考慮三硫化物水平的變異性。關鍵步驟是確保在開發過程中識別和了解潛在的變異性來源，以便能夠實施緩解戰略。

第2階段：偶聯反應

抗體功能化后，該過程的下一階段是偶聯反應以形成ADC分子。與ADC平臺之間差異很大的抗體功能化相比，根據我們的經驗，許多ADC平臺的偶聯反應階段相對一致。盡管存在這種一致性，但在偶聯反應階段仍存在獨特的開發挑戰，因為它是小分子和生物制劑制造之間的交叉點，也是有毒和無毒中間體結合形成ADC的點。

假設藥物中間體以固體粉末形式生產，第一步是制備要添加到偶聯反應中的藥物儲備溶液。由于ADC中使用的許多小分子藥物具有疏水性和低水溶性，因此有機溶劑通常用于藥物溶解。也可以將低水平的有機溶劑作為助溶劑添加到抗體溶液中，以在整個偶聯過程中保持藥物溶解度（圖40.9）。將藥物溶液添加到制備的抗體中導致偶聯形成ADC。通常，在可用的抗體偶聯位點上添加過量的藥物，以確保偶聯反應完成。偶聯完成后，偶聯的時間將取決于偶聯反應的動力學，一些過程將利用淬滅步驟來防止抗體與任何殘留的無殘留藥物在純化前發生副反應。淬火可以通過調節pH值、添加淬火試劑或其他方式來實現。

圖40.9典型ADC制造工藝的偶聯反應階段示意圖

用于偶聯的藥物量（即藥物：Ab摩爾比）通常是開發過程中需要研究的關鍵參數，因為在項目的開發階段，藥物通常生產成本高昂且供應短缺。藥物添加不足會導致未反應的偶聯位點殘留在Ab上，平均DAR較低，而過度添加會浪費有價值的藥物，可以而且可能導致某些化學試劑的脫靶偶聯。

另一個關鍵的開發決策是選擇用于藥物初始增溶的溶劑，并可能作為偶聯反應溶液中的助溶劑以保持藥物溶解度。使用的溶劑可能因藥物的性質、抗體和正在進行的反應而異，但最常見的是選擇極性非質子溶劑，例如二甲基亞砜（DMSO）、二甲基甲酰胺（DMF）或N，N-二甲基乙酰胺（DMA）。或者，如果證明可有效溶解所選藥物，則可以使用更蛋白質友好的溶劑，例如丙二醇。對所選溶劑的要求通常包括溶劑能有效溶解藥物、惰性、水溶性、在低濃度下與蛋白質相容，并且具有適當的高閃點，可用于非防爆設施。

對于偶聯反應開發，目標是將可用的抗體官能團與藥物充分反應以形成ADC，同時最大限度地減少聚集體的形成，最大限度地減少脫靶偶聯（取決于反應化學），并實現藥物的高效使用。在開發過程中研究的典型參數是反應pH值、溫度、抗體濃度、反應時間、溶劑選擇、溶劑百分比和添加藥物的摩爾當量。下面描述了在共軛階段遇到的挑戰示例。

最大限度地減少脫靶偶聯

在偶聯反應步驟的工藝開發過程中，了解相對于抗體中其他氨基酸官能團的偶聯靶位點化學選擇性非常重要。限制脫靶偶聯通常是一個焦點，因為它對產品質量和穩定性都有潛在影響。脫靶偶聯的傾向取決于所使用的反應化學成分以及工藝條件。

先前已報道過利用NHS接頭化學的賴氨酸定向ADC脫靶偶聯的一個例子。盡管NHS對伯胺具有選擇性以形成酰胺鍵，但也存在與絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸酸的副反應，形成相對不太穩定的乙酰化偶聯物。這些不太穩定的鍵會隨著時間的推移在溶液中水解，從偶聯物中釋放出接頭和藥物，從而影響ADC產物的平均DAR和游離藥物水平。此外，與賴氨酸以外的氨基酸偶聯會給產物增加額外的異質性，必須進行可重復的控制。

圖40.10偶聯反應時程研究顯示，當在接頭藥物上使用馬來酰亞胺官能團時，形成一種新的“奇數DAR”物質，該物質在鏈間半胱氨酸ADC的預期4和6 DAR形式之間洗脫

當使用馬來酰亞胺反應化學與抗體半胱氨酸反應時，也會出現脫靶偶聯，包括鏈間半胱氨酸ADC和THIOMAB藥物偶聯物。與抗體其他官能團的潛在副反應相比，馬來酰亞胺官能團與游離硫醇反應具有高度選擇性。然而，如果在偶聯過程中過量添加含馬來酰亞胺的藥物（這通常在ADC生產過程中出現），那么一旦消耗了可用的游離硫醇，不良的脫靶偶聯將成為主要反應。下面提供了鏈間半胱氨酸ADC平臺的非特異性馬來酰亞胺偶聯的示例，該平臺生成主要含有偶數DAR形式的偶聯物。然而，在過程穩健性研究中，觀察到偶聯時間的延長導致奇數DAR形式的水平升高，最突出的是明顯的5-DAR形式，增加了平均DAR并顯著改變了DAR物種組成（圖40.10）。這些變化被證明是含馬來酰亞胺的藥物與抗體賴氨酸的非特異性偶聯。然而，在較低的反應pH值下，脫靶偶聯反應的速率明顯較慢，這由5-DAR物質的形成速度較慢表明（圖40.11）。在較低pH值下，脫靶偶聯反應的動力學較慢，這意味著生產作更加穩健，避免了在某些步驟中短暫延遲生產可能導致由于該變體水平升高而導致批量剔除的風險。預計其他反應化學品也會面臨類似的反應特異性挑戰，尤其是在開發的后期階段，需要成為重點，以確保工藝的穩健性。

圖40.11“奇數DAR”物質（5DAR形式）的普遍性與反應pH值和時間的關系，與含有馬來酰亞胺的連接藥物偶聯的鏈間半胱氨酸ADC的函數關系。

最大限度地減少聚集體形成

偶聯反應開發和放大過程中的一個關鍵目標是控制聚集體的形成，聚集體是關鍵的質量屬性，因為它們對生物制品的安全性和有效性有潛在影響。在共軛下游實現聚集體去除步驟既具有挑戰性又成本高昂，因此，首選是將聚合保持在可接受的水平，以便不需要刪除共軛后。生物制品中聚集體生成的誘導因素已被廣泛研究，包括高溫、剪切應力、高蛋白質濃度、溶劑效應和化學改性。由于抗體功能化和偶聯過程中天然蛋白質結構的破壞（例如，鏈間半胱氨酸還原）、極疏水性藥物分子的附著以及制造過程中溶劑的使用，ADC可能特別容易受到聚集門控的影響。毫不奇怪，對于某些ADC來說，聚集體形成的傾向高于相應的未偶聯門控抗體。聚集體形成的傾向取決于抗體、藥物和接頭的特性，以及依賴于ADC平臺。

在ADC加工過程中，有多種潛在的方法可以限制聚集體的形成，從修改接頭藥物到改變偶聯反應參數。在ADC偶聯過程中減輕聚集體形成的策略將取決于正在形成的聚集體類型，這些聚集體可以大致分為兩種類型：作為ADC反應化學的副產物產生的共價聚集體，以及在過程中由其他應力產生的聚集體，與所使用的反應化學沒有直接關系（例如，高溫、剪切、高溶劑）。

共價聚集體的一個例子來自THIOMAB平臺，其中二硫鍵連接的聚集體可以在偶聯之前通過工程半胱氨酸形成。同樣，在使用異雙功能接頭SMCC修飾抗體后但在偶聯之前，衍生化抗體包含反應性馬來酰亞胺，該反應性馬來酰亞胺可與其他抗體生成共價聚集體。在這兩種情況下，降低蛋白質濃度、降低溶液pH值并最大限度地減少保持時間將最大限度地減少聚集體的形成。然而，防止共價聚集門形成的策略通常是平臺和化學特異性的，并且需要針對特定產品的開發。

用于生產ADC的疏水性藥物可能會驅動非共價聚集。設計小分子藥物以降低ADC的整體疏水性可以提高藥物的水溶性并限制ADC聚集。然而，由于這種方法也可能影響偶聯物的安全性和有效性，因此通常不會純粹為了制造利益而應用。或者，偶聯過程的其他方面可能有助于非共價聚集，包括在過程中使用高溫、快速混合速率（即高剪切力）或高濃度的有機溶劑。Hollander等研究了在制備卡連奇霉素偶聯物過程中使用添加劑（包括洗滌劑、醇類、氨基酸、脂肪酸和溶劑）來防止聚集的情況，發現使用乙二醇和辛酸的混合物進行偶聯可產生最小的聚集體。然而，尚不清楚聚集的減少是由于接頭藥物在該溶液中的溶解度增加、偶聯前溶液相卡利奇霉素結合之間的關聯發生變化，還是其他一些因素。

聚集體的形成也會受到過程中使用的工程參數的影響，例如試劑添加速率、混合速率或其他剪切應力來源。對于一個ADC過程，我們觀察到當該過程以緩慢的藥物添加速率和最小的攪動進行時，聚集物質水平增加（圖40.12）。這些結果表明，該抗體暴露于含有高溶劑濃度或高藥物濃度的局部環境中會誘導聚集體形成。

圖40.12使用慢速、目標速度或快速添加藥物（制備為100%有機溶劑中的儲備溶液）進行偶聯產生的聚集體水平和SEC-HPLC曲線

第三階段：純化和配制

偶聯后通常存在游離藥物和溶劑，需要純化和制劑步驟才能生成ADC原料藥。超濾/滲濾（UF/DF）是緩沖液交換生物產品（包括ADC）的標準方法。UF/DF膜具有一系列標稱截留分子量（NMWCO），包括5、10或30kDa，這使得這些步驟能夠有效地保留產品，同時去除許多低分子量雜質，包括潛在的溶劑、游離藥物和藥物相關雜質。圖40.13顯示了UF/DF對“表現良好”ADC的溶劑和殘留游離藥物的代表性清除率，它證明了去除兩種雜質的近乎理想的篩分系數（S=1）。（在非常低的濃度下，溶劑去除變得不理想，這可能是由于溶劑從膜中的反彈效應，或者是由于UF/DF系統的溶劑與塑料成分之間的相互作用）。在UF/DF有效去除偶聯反應中殘留的所有雜質到可接受水平的情況下，如本例中所示，UF/DF可能是偶聯下游唯一需要的純化步驟。

圖40.13 UF/DF作過程中的雜質清除率作為去除（A）殘留溶劑和（B）游離藥物的直徑的函數

與上述示例相比，UF/DF可能無法清除游離藥物和游離藥物相關雜質，用于不太“表現良好”的ADC工藝。即使雜質的分子量明顯低于UF/DF膜的NMWCO，也可以觀察到這種情況。圖40.14顯示了在使用30kDaNMWCO膜的UF/DF過程中兩種分子量均為<2kDa的游離藥物相關雜質的清除行為。一個特異性雜質A穿過UF/DF膜，并通過步驟被>2個對數級清除，而雜質B在10個雙體積的過程中沒有明顯清除。在UF/DF期間游離藥物滯留的機制目前尚不清楚，但可能部分是由于藥物的自身締合增加了其在水性環境中的表觀大小，或者游離藥物與ADC之間的非特異性相互作用。如果UF/DF步驟無法將游離藥物和相關雜質清除到可接受的水平，則需要其他純化步驟，其中可能包括色譜純化（參見下面的案例研究）或通過活性炭過濾吸附游離藥物。除了去除游離藥物外，如果偶聯反應產生無法接受水平的產物變體或聚集體，則可能需要對ADC進行色譜純化。

當UF/DF成功清除溶劑和游離藥物種類，并且不需要去除產品變體時，對于遵循標準UF/DF工藝的ADC，下游純化和制劑步驟的開發相對簡單。在這些情況下，純化和制劑步驟的預期收率相對較高，為90%–95%。以下部分提供了在單獨使用UF/DF無法獲得可接受的ADC產品質量的情況下開發的其他純化作示例。除了增加工藝的復雜性外，這些額外的步驟還會顯著降低工藝產量，具體取決于所采用的方法。

圖40.14 UF/DF作期間的雜質清除數據顯示為游離藥物相關雜質（包括（A）雜質A和（B）雜質B）的直徑體積的函數

去除游離藥物

結合和洗脫色譜是一種通用的從ADC中去除游離藥物的方法，它利用了ADC和游離藥物之間顯著不同的分子特性。在這種方法中，調整包含游離藥物和溶劑的偶聯反應環境并將其加載到色譜柱上，該色譜柱根據離子、親和力或與樹脂的其他相互作用特異性吸附ADC，同時游離藥物和殘留溶劑流經色譜柱。某些填料可能與游離藥物存在非特異性相互作用，因此建議進行填料篩選，并且可能需要進行洗滌步驟以確保完全去除游離藥物。

表40.3圖40.15所示的游離藥物去除步驟的陽離子交換色譜詳細信息

樣品色譜運行條件和代表性色譜圖分別顯示在表40.3和圖40.15中，用于使用在結合和洗脫模式下作的陽離子交換劑從ADC中去除游離藥物。在這種情況下，使用色譜柱的梯度洗脫，但也可以對產物進行階梯洗脫。然后可以在色譜池上進行UF/DF，一旦去除了UF/DF共純化的低分子量雜質，就可以配制原料藥。

圖40.15根據表40.3所述的條件進行陽離子交換色譜運行以去除ADC中的游離藥物的色譜圖

去除聚集體

如本章前面所討論的，由于對高效化合物進行大規模色譜相關的挑戰以及此類步驟可能造成的產量損失，因此不首選對ADC進行色譜純化以去除聚集體。然而，如果聚集體的產生水平對于ADC產物來說是不可接受的，則可以采用標準抗體純化方法去除ADC聚集體。

高通量批量結合篩選可用于有效識別和優化抗體的純化條件[70]。這些技術可以應用于低通量（手動）或高通量（機器人）形式的ADC工藝開發，盡管需要額外的控制措施來確保正確處理強效化合物以及設備與所需水平的有機溶劑的化學相容性。

CEX是從非偶聯抗體中去除聚集體的標準方法，也可用于偶聯不影響抗體電荷的情況下的ADC聚集體去除（例如，半胱氨酸定向偶聯化學；不帶電荷的連接子藥物）。使用抗體及其相關ADC（鏈間半胱氨酸ADC格式）進行的陽離子交換（CEX）樹脂篩選實驗的結果如圖40.16所示。抗體中間體和ADC在該CEX樹脂上具有相似的結合行為（即，作為pH值和促成率的函數的相似分配系數），但在某些條件下與偶聯物的結合稍強。對于該分子，連接子藥物的連接不會顯著影響蛋白質結合，并且可以使用與未偶聯抗體類似的CEX運行條件純化ADC。相比之下，賴氨酸定向ADC預計具有顯著不同的結合行為，因為每次賴氨酸修飾都會丟失一個帶電基團。作為CEX的替代方法，陶瓷羥基磷灰石純化已被用于賴氨酸定向ADC平臺去除聚集體。

圖40.16批量吸附等值線圖，顯示抗體及其對應藥物偶聯物在陽離子交換色譜樹脂上的結合行為。根據前面描述的方法繪制等高線圖。

色譜純化ADC時的另一個考慮因素是分離是否也會影響平均DAR或DAR物質組成，這可能取決于所選的分離模式。因此，在純化步驟的開發過程中，除了聚集體水平外，還應監測這些產品質量屬性。在開發階段，還必須考慮溶劑和游離藥物對色譜系統性能和色譜柱重用的潛在影響。

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