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星形膠質(zhì)細(xì)胞（Astrocytes）是大腦組織中最為豐富的一類神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞（Glial cell），不僅發(fā)揮支架/支持作用，同時還參與損傷修復(fù)、神經(jīng)遞質(zhì)代謝、信息傳遞、維持神經(jīng)元周圍離子平衡、神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)等過程，扮演重要功能角色。

傳統(tǒng)皮質(zhì)類器官（Cortical Organoid）培養(yǎng)系統(tǒng)由于皮質(zhì)中膠質(zhì)細(xì)胞分化增殖延時（滯后），導(dǎo)致腦皮質(zhì)類器官中缺乏合適比例的星形膠質(zhì)細(xì)胞，無法更好模擬體內(nèi)真實細(xì)胞比例和微環(huán)境，極大限制了皮質(zhì)類器官模型在大腦發(fā)育（Brain Development）和腦疾病發(fā)病機(jī)制（pathogenesis of Brain Disorders）研究中的應(yīng)用。

圖1|神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞及其分類示意圖

近日（2025/1/18），美國加州索爾克生物研究所遺傳學(xué)實驗室Fred H Gage團(tuán)隊在Nature Biotechnology (IF:33)雜志發(fā)表了題為“Morphological diversification and functional maturation of human astrocytes in glia-enriched cortical organoid transplanted in mouse brain”。

該研究優(yōu)化了傳統(tǒng)皮質(zhì)類器官構(gòu)建方法，成功構(gòu)建了含有正常比例星形膠質(zhì)細(xì)胞的腦皮質(zhì)類器官（細(xì)胞占比25-31%），且進(jìn)一步類器官腦內(nèi)移植實驗顯示，移植后的類器官能穩(wěn)定產(chǎn)生神經(jīng)元和多種亞群的星形膠質(zhì)細(xì)胞，能實現(xiàn)再現(xiàn)星形細(xì)胞多樣性和促進(jìn)星形細(xì)胞功能成熟。

在此基礎(chǔ)上，Fred H Gage還探索了富含星形膠質(zhì)細(xì)胞的皮質(zhì)類器官模型在急性炎癥研究中的應(yīng)用，并發(fā)現(xiàn)星形細(xì)胞的一個亞群，在細(xì)胞因子刺激下快速激活促炎信號通路。

最后，該研究在還揭示了：在反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞中，CD38信號在介導(dǎo)細(xì)胞代謝和線粒體應(yīng)激中扮演重要角色。總的來說，該模型為研究人類星形膠質(zhì)細(xì)胞的功能提供了一個強(qiáng)大的平臺。

含正常比例星形膠質(zhì)細(xì)胞的皮質(zhì)類器官的構(gòu)建方法

Part-1hiPSCs/hESCs細(xì)胞培養(yǎng)

干細(xì)胞用培養(yǎng)基（STEMCELL Technologies, 85850）重懸后并計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度，接種于基質(zhì)膠（干細(xì)胞專用基質(zhì)膠，品牌：Orgmatrix，貨號：141010）包被的培養(yǎng)板，置于5% CO2濕熱培養(yǎng)箱中靜態(tài)培養(yǎng)，通常每3-6天傳代1次，傳代比例約1:6。干細(xì)胞能在體外擴(kuò)增20-40代次，使用前進(jìn)行支原體檢測，確保無污染。

圖2 | 含正常比例星形膠質(zhì)細(xì)胞的皮質(zhì)類器官培養(yǎng)進(jìn)程

Part-2胚狀體制備

選擇培養(yǎng)中狀態(tài)良好的干細(xì)胞，用1 mg/ml Ⅵ型膠原酶消化在37℃下消化細(xì)胞20-40 min，然后用細(xì)胞刮機(jī)械分離細(xì)胞。解離后去除培養(yǎng)基，添加新鮮培養(yǎng)基（含10 mM ROCK inhibitor Y-27632），然后細(xì)胞接種于低細(xì)胞吸附能力培養(yǎng)板中靜態(tài)培養(yǎng)2天。

Part-3類器官培養(yǎng)1-14d

胚狀體培養(yǎng)基更換為星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基（AstroM; ScienCell, 1800），并添加2% FBS、500 ng/ml Noggin（R&D Systems, 6057-NG）、10 ng/ml PDGF-AA（Proteintech, HZ-1215）、1× 2-巰基乙醇。持續(xù)培養(yǎng)至第14天。

Part-4類器官培養(yǎng)15-21d

類器官接種至6孔板中（超低吸附培養(yǎng)板），每孔接種10-12個類器官，并轉(zhuǎn)移到定軌震動搖床（75-rmp），置于5% CO2濕熱培養(yǎng)箱中靜態(tài)培養(yǎng)，培養(yǎng)基為形狀細(xì)胞培養(yǎng)基添加AGS，10 ng/ml PDGF-AA，1× 2-巰基乙醇。持續(xù)培養(yǎng)1周。

Part-5類器官培養(yǎng)22-60d

培養(yǎng)基更換為含Gluta MAX的DMEM/F-12，并添加Glutamax、1× N2添加物、1× B27（without RA; Thermo Fisher Scientific, 12587010）、1×MEM-NEAA （Thermo Fisher Scientific, 11140050）, 10% FBS以及1×2-巰基乙醇。持續(xù)培養(yǎng)至第60天。

Part-6類器官培養(yǎng)61d

類器官培養(yǎng)至第60天后，上一步驟中培養(yǎng)基添加20 ng/ml BDNF（BDNF; R&D Systems, 248-BDB）、20 ng/ml GDNF（GDNF; R&D Systems, 212-GD）、0.2 mM抗壞血酸（維生素C）（AA; STEMCELL Technologies, 72132）和0.5 mM環(huán)腺苷酸（cAMP; Tocris Bioscience, 1141）。持續(xù)培養(yǎng)，每隔一天更換一次培養(yǎng)基。

Part-7熒染色鑒定星形膠質(zhì)細(xì)胞

利用細(xì)胞分子標(biāo)志物GFAP, EOMES, CTIP2, SATB2, SOX2, NeuN等通過免疫熒光染色，分析優(yōu)化升級后的類器官中各種細(xì)胞類型、大體比例及其分布。

圖3 |皮質(zhì)類器官中星形膠質(zhì)細(xì)胞鑒定

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