腦聲小店基于深度科研洞察，專注為動物實驗提供"簡器械·精實驗"解決方案。我們突破高精設備局限，開發(fā)手工定制化儀器及配件，通過科研巧思將基礎工具轉(zhuǎn)化為創(chuàng)新實驗方案。產(chǎn)品涵蓋行為學裝置、操作輔助工具等，使實驗室在保持操作簡效的同時，實現(xiàn)精細化數(shù)據(jù)采集，助力科研人員以創(chuàng)造性思維發(fā)掘簡易儀器的潛在科研價值。

01

皮炎慢性癢模型

將成年雄性C57/BL6J小鼠隨機分成3組，每組6只，使用小動物麻醉機將小鼠誘導麻醉5min之后（氧分壓1L/min，流速3%），使用胰島素針在小鼠頸背部進行皮內(nèi)注射，注射量為10μL His或CQ（10μg/μL），對照組注射生理鹽水。

待小鼠清醒后，放入特制行為箱中，進行癢行為學檢測，錄像40min。使用VisuScratch軟件進行搔抓次數(shù)計數(shù)。

02

特應性皮炎慢性癢模型

1）將成年雄性C57/BL6J小鼠隨機分成2組，每組10只進行造模處理。

2）在模型組小鼠雙側(cè)耳部內(nèi)外兩側(cè)分別涂抹卡泊三醇溶液15μL，對照組小鼠雙側(cè)耳部內(nèi)外兩側(cè)分別涂抹無水乙醇溶液15μL，連續(xù)21d。

3）將兩組小鼠放入特制行為箱中，進行癢行為學檢測，錄像40min。

4）使用Boris軟件進行搔抓次數(shù)計數(shù)。

03

行為學檢測

高架十字迷宮實驗（Elevated Plus maze，EPM）本實驗使用高出地面70cm的設備進行，由兩個開放臂（30cm×5cm），兩個閉合臂（30cm×5cm×15.5cm）和一個中央?yún)^(qū)（5cm×5cm）組成。實驗開始前將兩組小鼠放入行為室中適應2h，實驗時將小鼠放入中央?yún)^(qū)域同時將小鼠的頭朝向開放臂，使用錄像裝置錄制小鼠在該裝置中5min的活動軌跡，最后使用VisuTrack軟件對視頻進行分析，分別計算小鼠在開放臂運動的時間百分比和距離百分比來評估焦慮水平。

曠場實驗（Open field test，OFT）本實驗裝置由四個底為白色，四周為黑色的50cm×50cm×35cm的箱子組成。實驗開始前將兩組小鼠放入行為室中適應2h，實驗時將小鼠慢慢放入中央?yún)^(qū)域，使用錄像裝置錄制小鼠在該裝置中10min的活動軌跡，每只小鼠結(jié)束后，使用75%酒精對該設備擦拭3遍，確保無糞便和氣味后放入下一只小鼠，最后使用VisuTrack軟件對視頻進行分析，分別計算小鼠在中心區(qū)域運動的時間百分比和距離百分比來評估焦慮水平。

在小鼠耳部連續(xù)涂抹卡泊三醇溶液21d后，對其進行焦慮行為檢測，結(jié)果顯示：在曠場行為實驗中，和對照組相比，模型組小鼠在中央?yún)^(qū)停留的時間低于對照組小鼠。在高架十字迷宮實驗中，和對照組相比，實驗組小鼠在開臂的停留時間低于對照組小鼠，提示實驗組小鼠存在焦慮樣行為。

慢性癢模型小鼠存在焦慮樣行為

A．慢性癢模型小鼠及對照組小鼠在曠場實驗活動軌跡的典型圖。B.小鼠在曠場中心區(qū)域停留的時間百分比和距離百分比統(tǒng)計結(jié)果。C．慢性癢模型小鼠及對照組小鼠在高架十字迷宮實驗活動軌跡的典型圖。D.小鼠在高架十字迷宮開臂停留的時間百分比和距離百分比統(tǒng)計結(jié)果。

04

光遺傳學病毒注射及光纖埋置

雙側(cè)mPFC注射rAAV-EF1α-DIO-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-hGH pA；rAAVEF1α-DIO-eNpHR3.0-mCherry-WPRE-hGH pA；rAAV-EF1α-DIO-EYFP-WPRE-hGH pA。留針15min后縫合，將小鼠放回原籠，3周后，進行光纖埋置。

將夾持器攜帶陶瓷插芯固定于定位儀臂上，根據(jù)公式計算15度角光纖位點，換算公式為ML’=ML*cosβ+DV*sinβ；DV’=DV*cosβ-ML*sinβ，算得光纖埋置位點坐標為AP=+1.92mm，ML=±0.87mm，DV=-2.10mm。因光遺傳學需要光照到被病毒感染的核團，因此應抬高0.3mm。

在小鼠顱骨表面對應位置鉆孔，并清掉其孔內(nèi)殘留小骨片以方便光纖置入。

將光纖埋置于目標腦區(qū)后使用牙科水泥將光纖外部與顱骨表面固定，待水泥完全干后埋置完成。

將小鼠放回原籠，一周后進行行為學檢測。

05

化學遺傳學

1）病毒注射同第一部分，雙側(cè)mPFC分別注射rAAV-EF1α-DIO-hM3D（Gq）-mCherry-WPREs；rAAV-EF1α-DIO-hM4D（Gi）-mCherry-WPREs或rAAV-EF1α-DIO-EYFP-WPRE-hGH pA，速率為20nL/min。

2）化學遺傳學病毒注射位點AP=+1.92mm，ML=±0.30mm，DV=-2.26mm。

3）留針15min后縫合，將小鼠放回原籠。

4）三周后進行行為學檢測前40min在小鼠腹腔注射0.75mg/mL氯氮平N-氧化物（Clozapine N-oxide，CNO），4μL/g體重。

06

光遺傳學

1）待檢測小鼠在行為檢測箱體中適應3d，每次30min。

2）將光纖跳線和小鼠腦部陶瓷插芯中的光纖連接，另一端與激光器光源相連。

3）473nm激光光源設置為，頻率20Hz，波寬5ms，功率為5-7mw。進行

3min OFF-3min ON的循環(huán)，持續(xù)30min并錄像。

4）589nm激光光源設置為持續(xù)光，功率為5-7mw。進行3min OFF-3min ON的循環(huán)，持續(xù)30min并錄像。

5）錄像結(jié)束后通過VisuScratch軟件對小鼠抓撓行為進行計數(shù)。

07

在體光纖記錄

1）待檢測小鼠在行為檢測箱體中適應3d，每次30min。

2）將光纖跳線和小鼠腦部陶瓷插芯中的光纖連接。

3）熒光信號通過473nm（OBIS 488LS；Coherent）激光器發(fā)出，激光器功率0.01-0.02mw，強弱變化的熒光信號經(jīng)過光纖傳回至探測光路，經(jīng)光學轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)換為可被采集的電壓信號，經(jīng)過濾波放大后利用光纖記錄系統(tǒng)記錄鈣信號。

4）將GCaMP6s的信號與抓撓行為通過Matlab軟件將抓撓行為和時刻點相對應，得到的數(shù)據(jù)根據(jù)熒光變化（ΔF/F）計算為（F-F0）/F0，其中F為每個時刻點的熒光值，F(xiàn)0表示基線周期熒光值的中位數(shù)，取各組動物的ΔF/F值的平均值

5）定義抓撓前（-10，-6）為基線期，（-2，0）為抓撓行為開始前，（0，2）為抓撓行為發(fā)生后。

為了驗證mPFC內(nèi)SST陽性神經(jīng)元是否參與癢覺信息的傳遞，在SST：Ai9小鼠上建立CQ及His兩種急性癢模型，隨后放入特制行為箱中進行癢覺行為錄像，使用Boris軟件進行人工計數(shù)后，對照組30min內(nèi)抓撓次數(shù)為（13.16±4.99）次，His組30min內(nèi)抓撓次數(shù)為（98.33±16.87）次；CQ組30min內(nèi)抓撓次數(shù)為（124.50±16.97）次，His、CQ誘發(fā)的小鼠抓撓次數(shù)顯著高于對照組。

參考文獻：

• 梁怡. 內(nèi)側(cè)前額葉皮層生長抑素神經(jīng)元在癢覺的作用及機制研究[D].延安大學,2024.DOI:10.27438/d.cnki.gyadu.2023.000789.

• Prefrontal GABAergic Interneurons Gate Long-Range Afferents to Regulate Prefrontal Cortex-Associated Complex Behaviors [J]. Yang Sha Sha;Mack Nancy R.;Shu Yousheng;Gao Wen Jun.Frontiers in Neural Circuits,2021

• Somatostatin, a Presynaptic Modulator of Glutamatergic Signal in the Central Nervous System.[J]. Pittaluga Anna;Roggeri Alessandra;Vallarino Giulia;Olivero Guendalina.International journal of molecular sciences,2021

• The mouse prefrontal cortex: Unity in diversity[J]. Le Merre Pierre;?hrlund Richter Sofie;Carlén Marie.Neuron,2021