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01

神經毒素類模型

MPTP模型

MPTP是一種用于建立PD模型的神經毒素，現已對神經元中MPTP毒性機制進行了深入研究。MPTP是一種親脂性分子，容易穿過血腦屏障。全身給藥后，MPTP被星形膠質細胞中的單胺氧化酶B轉化為MPTP＋，然后被氧化為有毒的代謝物MPP＋。通過多巴胺轉運蛋白被多巴胺能神經元選擇性攝取，并抑制線粒體復合物Ｉ的電子傳遞鏈，導致氧化應激和三磷腺苷生成減少，引起帕金森綜合癥。不同動物種類具有不同的MPTP敏感性。與靈長類動物相比，嚙齒類動物對MPTP的毒性的敏感性更低，其中小鼠的敏感性最高，且由于小鼠飼養成本低、易處理、可重復性高，使用最為廣泛。MPTP不同注射方法或部位會導致不同的臨床現象，皮下注射或靜脈注射表現為雙側PD，單側頸動脈注射主要誘發單側PD。快速和短暫的神經變性導致大多數PD動物模型應用受限，而慢性MPTP模型病程漸進且與PD患者臨床癥狀最為吻合，同時可觀察到α-Synuclein沉積現象。使用亞急性MPTP小鼠模型表現出嚴重的多巴胺能神經元丟失和明顯的星形膠質細胞增生，但它們未能表現出明顯的運動障礙和認知缺陷。

6-OHDA模型

6-OHDA是一種較為常見的大鼠PD模型建立的方法，是與多巴胺結構上相似的兒茶酚胺類物質，不能透過血腦屏障，因此在研究過程中多采用局部腦室定位注射，包括紋狀體、內側前腦束和黑質。6-OHDA模型通常是造模時間短的急性損傷模型，在注射后的幾天內具有高水平的黑質致密部多巴胺能細胞死亡，與人PD病情進展緩慢的特點相反。該模型也無法表現出LB的聚集，這是PD病理學的關鍵部分。該模型病變的程度取決于６?ＯＨＤＡ的注射量、注射部位和使用的種類。單側6-OHDA注射模型是目前使用率最高的PD模型，其在多巴胺激動劑治療時產生定向旋轉，旋轉行為檢測是可信度高的評價指標。單側6-OHDA注射能選擇性毀損多巴胺能神經元，可直接比較注射部位的同側和對側，可有效用于研究治療PD藥物的效果。通常避免雙側注射，其會誘導明顯的吞咽障礙，死亡率高。

魚藤酮模型

魚藤酮造模法模擬農藥環境，更貼合人由于長期接觸農藥、暴露于農藥環境而引起的PD病癥。魚藤酮具有較高的脂溶性，能穿過血腦屏障。首個魚藤酮模型是將極高濃度魚藤酮通過立體定向注入神經元細胞，其導致紋狀體多巴胺和5-羥色胺顯著減少。魚藤酮主要作用機制是引起機體氧化應激反應，與線粒體復合酶結合加重線粒體氧化應激，從而造成更嚴重的損傷，同時還會導致α-Synuclein、蛋白酶功能障礙等。魚藤酮的優點是可以引起與人臨床PD相似的病理特征，但由于其高度的脂溶性，會在全身引起非PD典型癥狀，且其造模方法與環境條件密切相關，不容易形成穩定的PD模型。

百草枯模型

百草枯是一種廣泛使用的除草劑，是可能誘發PD的一個環境因素，根據其對MPP＋的結構相似性被鑒定為神經毒性物質，但它并不像MPP＋那樣抑制線粒體復合體Ⅰ。百草枯損害谷胱甘肽和硫氧還蛋白的氧化還原循環，進一步影響細胞抵御氧化應激的功能。百草枯能夠導致α-Synuclein過表達和誘導黑質致密部多巴胺能神經元中LB樣結構。然而，該模型沒有顯示氧化應激和神經元細胞死亡之間的任何聯系。因此，百草枯在PD模型中的應用通常僅限于研究多巴胺能神經元中LB的形成和α-Synuclein的作用，由于缺乏特異性和動物的高死亡率，這嚴重限制了它們在PD中的研究。

02

基因工程模型

α-Synuclein是一種由SNCA基因編碼的小型蛋白質，在中樞神經系的突觸前末端大量表達，已知它與膜蛋白和囊泡動力學調節有關。α-Synuclein是路易體的主要組成部分，α-Synuclein的復制或三聯體在PD進展中起關鍵作用，其突變是導致遺傳性PD的主要原因。

Parkin是一種泛素連接酶，由PRKN基因編碼，是導致早發性PD最常見的常染色體隱性突變，該酶失活會導致家族性與散發性PD。

PINK1是一種神經保護激酶，主要存在于線粒體和胞質間隔中，在神經元分化中發揮作用。PINK1突變與隱性PD有關，其突變體表現出多巴胺能神經元變性和運動缺陷。

DJ-1是一種抗氧化蛋白，其突變與常染色體隱性PD有關。DJ-1在抗氧化防御中發揮重要作用，保護細胞免受氧化應激，但其確切功能尚不清楚。DJ-1基因敲除小鼠的紋狀體中多巴胺水平下降，運動能力受損，但黑質致密部中多巴胺能神經元沒有損失。DJ-1敲除大鼠可能是評估PD前驅期的一個有前途的模型，需要進一步的評估。

03

其他

除了上述幾種經典的造模方法，在PD模型應用過程中，也有一些研究者使用脂多糖、乳清蛋白、腺病毒等其他造模誘導物質，以及使用線刀機械損傷模型。脂多糖是一種嚴重的致炎因子，可誘導α-Synuclein在腸道產生，并逐漸轉移至腦部，引起黑質內酪氨酸羥化酶減少，模型動物運動功能下降等病理、行為等方面改變。

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04

一般行為學表現

小鼠首次腹腔注射 MPTP約15-20min 后，動物即出現不同程度的肢體震顫、豎毛、弓背屈身、豎尾等急性反應，伴隨有輕度活動減少、反應遲緩、喜靜等表現，上述癥狀約持續30-60min后逐漸減輕，并趨于恢復正常。

曠場實驗

實驗前小鼠置于測試環境中適應至少半小時。將小鼠放在27cm×27cm×35cm大小不透明測試盒的中央,攝像機放于盒子的正上方。利用Smartv3.0系統記錄小鼠10min的活動情況。每只小鼠檢測結束后,用體積分數0.75的乙醇清理曠場區域,并在測試時保持干燥。分析在10min的曠場實驗中小鼠的移動總距離和中心區探索時間,評估小鼠的運動行為和焦慮程度。

(1)在中心區域停留的時間百分比：Duration In Center (%)；

(2)在曠場中運動的總距離（cm）：Distance (cm)；

(3)在曠場中的平均速度：Average Velocity (cm/s)；最小速度：Min Velocity(cm/s)；最大速度：Max Velocity (cm/s)；

(4) 停頓次數：Moving Frequency；在曠場中的運動的持續時間百分比：Moving Duration (%)；

(5) 糞便數量：Number of Faeces；

(6) 小鼠身體姿勢運動狀態的頻率和持續時間百分比：伸展的頻率：Stretch Frequency；正常的頻率：Normal Frequency；蜷縮的頻率：Hunch Frequency；伸展的持續時間百分比：Stretch Duration (%)；正常的持續時間百分比：Normal

Duration (%)；蜷縮的持續時間百分比：Hunch Duration (%)。

震顫麻痹評分

小鼠采用腹腔注射給藥，立即進行觀察，持續3h。評分標準為:0分，與正常小鼠相似，無任何癥狀;1分，出現豎毛、弓背、間斷性細小震顫，但活動自如;2分，出現吞咽頻繁，頻繁性震顫，后肢張開，顫尾，活動逐漸受限;3分，出現流涎、持續性震顫，四肢僵硬，活動受限;4分，因全身麻痹而死亡。

爬桿實驗

給藥前3d，每天進行一次爬桿訓練。給藥結束后第3天開始，每天一次測量，持續到第7天。將一直徑為2.5cm的塑料球固定于長50cm、粗1.5cm的亞克力桿頂端，纏上紗布以防打滑，然后將被測小鼠置于球上，記錄由球上爬至桿子底部所需時間。評分標準為:0分，爬桿時間＜4.01s;1分，爬桿時間為4.01～8.0s;2分，爬桿時間為8.01～12.0s;3分，爬桿時間＞12.00s。

懸掛實驗

給藥結束后第3天開始，每天進行一次實驗，持續到第7天。被測小鼠倒置懸掛，將兩前爪置于30cm長，25cm高水平電線中點，而后放開小鼠，記錄其抓握情況。評分標準為，0分，兩后爪均可抓住電線;1分，一只后爪可抓住電線;2分，兩只后爪均不能抓住電線。如出現后爪反復抓取電線，間斷可抓住現象，可記為0.5分。

轉棒法檢測

術后１周開始，將大鼠置于正在運轉的轉棒儀上（恒定轉速24r/min），開始計時。記錄大鼠在轉棒上停留的時間和2分鐘內掉落的次數，以此表示其運動協調能力。每只大鼠測定3次，每次間隔30分鐘，取平均值，連續檢測6周。

旋轉法檢測

術后１周開始，轉棒實驗結束6小時后，腹腔注射APO以誘發大鼠旋轉行為，注射藥物5分鐘后，記錄大鼠的旋轉方向及30分鐘內的旋轉圈數，連續檢測6周。平均向注射側（右側）旋轉速度≥7r/min為建立成功的PD模型大鼠。

膠布移除實驗

用于評價動物的運動協調能力。將一0.5cm×0.5cm大小的醫用膠布貼于小鼠鼻部，記錄小鼠從貼上膠布至完全移除整個過程所用時間，以此作為評價動物運動協調能力的指標，測試3次取均值，每次間隔至少5min，最長觀察時間為60s，超過60s則重新檢測。

步態分析

用于評價動物的運動平衡能力。于實驗周期第12天至第14天每天對各組小鼠進行1次步態訓練。將動物逆向跑帶行進方向放入水平步態儀的透明隔箱中，設置跑帶速度為10cm/s，用VisuGait動物步態檢測分析系統記錄小鼠連續10s內的動態步態行為指標：包括腳爪接觸總面積和腳爪與動物運動方向長軸所形成的角度。每只動物均獲取3次數據（每次間隔時間至少10min），統計取均值。每換1次鼠用浸有肥皂水的棉布條徹底清理跑帶，避免氣味干擾。采用步態分析軟件采集小鼠爪印，步態分析參數包括步幅、站立時間百分比、搖擺時間百分比、步幅寬度、平均印痕面積等。

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