摘要：生產(chǎn)高效抗體-藥物偶聯(lián)物（ADC）是一項艱巨的任務(wù)——將有機(jī)合成與生物技術(shù)生產(chǎn)相結(jié)合。因此，必須解決一系列新的和獨(dú)特的工程和化學(xué)挑戰(zhàn)，以支持臨床試驗和商業(yè)生產(chǎn)。這些應(yīng)用包括開發(fā)可靠的工藝，實現(xiàn)一致的產(chǎn)品特性，以及建立ADC特異性分析方法和處理細(xì)胞毒性化合物的安全策略。本綜述重點(diǎn)介紹了ADC的工藝開發(fā)和放大生產(chǎn)，并重點(diǎn)介紹了此類工藝中最重要的特征。

【NO.1】ADC工藝開發(fā)：為什么以及如何開發(fā)？

抗體-藥物偶聯(lián)物（ADC）是一類新的、有前途的癌癥治療藥物。ADC由三部分組成：對腫瘤抗原具有特異性的單克隆抗體（mAb）、接頭種類和細(xì)胞毒性有效載荷。抗體部分允許細(xì)胞毒性藥物的靶向遞送，而其他藥物由于其治療窗口狹窄而通常不適合患者治療。強(qiáng)效藥物需要附著在抗體上，而不會干擾后者的生物學(xué)特性。與細(xì)胞毒性有效載荷相比，抗體的生物物理特性（例如其大小和疏水性水平）差異很大，這可能對ADC的生產(chǎn)構(gòu)成巨大挑戰(zhàn)。必須特別小心地處理抗體，因為它容易受到高溫和溫度波動以及高攪拌速率的影響。細(xì)胞毒性藥物通常具有很強(qiáng)的疏水性，這需要使用有機(jī)助溶劑，這些助溶劑也必須對抗體部分具有耐受性。這只是ADC綜合過程中遇到的一些挑戰(zhàn)的例證。

圖1：ADC工藝的典型工藝開發(fā)活動

通常，在藥物發(fā)現(xiàn)階段設(shè)計了合成新的和有前途的ADC的程序。那么，為什么需要花費(fèi)時間和金錢進(jìn)行廣泛的過程開發(fā)呢？工藝開發(fā)工作的價值在項目的后期階段變得明顯。在生產(chǎn)用于毒理學(xué)和臨床研究的材料之前，已經(jīng)設(shè)定了主要工藝參數(shù)的項目，可以降低在后續(xù)生命周期中實施工藝變更的相關(guān)風(fēng)險。這使得質(zhì)量相當(dāng)?shù)牟牧峡梢栽谒须A段使用。

如何設(shè)計工藝開發(fā)方案？首先，必須確定開發(fā)目標(biāo)。確保適合可用生產(chǎn)設(shè)施的可靠和安全的工藝是一個顯而易見的目標(biāo)。但是，在生產(chǎn)規(guī)模上制備生物制藥之前，如何評估工藝開發(fā)的成功呢？在整個開發(fā)階段，在分子水平上對ADC特性進(jìn)行徹底控制，可以確信已經(jīng)建立了可靠、穩(wěn)健的工藝。藥物抗體比（DAR）、單體含量以及盡可能的連接位點(diǎn)等特性需要通過工藝來控制。此外，這些可分析可追溯的特征可以成為產(chǎn)品質(zhì)量的關(guān)鍵指標(biāo)。此外，ADC活性，如細(xì)胞殺傷測定所示，必須被靶抗原識別，如ELISA等抗原結(jié)合測定所證明的那樣。

通常，開發(fā)計劃從熟悉階段開始，以測試和評估初始工藝參數(shù)集，然后在實際工藝開發(fā)階段進(jìn)行完善（見圖1）。在此階段，對各種工藝參數(shù)進(jìn)行詳細(xì)研究，例如，在所謂的實驗設(shè)計（DoE）設(shè)置中。在下一步中，優(yōu)化的工藝參數(shù)將在多次驗證運(yùn)行中進(jìn)行檢查。如果有代表性的縮小模型可用，所有這些作都可以在毫克尺度上形成。此后，可以嘗試將抗體起始材料的克數(shù)首次擴(kuò)大到克數(shù)，并探索純化步驟。然后，該工藝通常可以擴(kuò)大到>100g級別以提供毒理學(xué)和早期臨床研究。在走向商業(yè)化工藝的過程中，需要對ADC制造進(jìn)行徹底調(diào)查的工藝認(rèn)證階段，以滿足所有監(jiān)管需求，從而形成一個特征明確的工藝，可以在1kg或更大的規(guī)模下執(zhí)行。

【NO.2】熟悉工藝

在典型的ADC工藝中，只有少數(shù)反應(yīng)參數(shù)影響DAR。與Seattle Genetic基于馬來酰亞胺的偶聯(lián)技術(shù)一樣，對于半胱氨酸偶聯(lián)物DAR定義步驟通常是抗體的部分還原。更具體地說，還原劑（如三（2-羧乙基）膦（TCEP）的化學(xué)計量控制了產(chǎn)生的游離硫醇數(shù)量[9]。在下一步中，游離硫醇基團(tuán)然后與選擇的藥物連接子分子偶聯(lián)（見圖2）。對于基于賴氨酸偶聯(lián)的ADC，如免疫原性的靶向抗體有效載荷（TAP）技術(shù)，使用相應(yīng)的接頭對抗體進(jìn)行修飾通常定義了負(fù)載比。因此，在實際藥物偶聯(lián)之前，這些抗體修飾步驟需要對這兩種類型的偶聯(lián)技術(shù)進(jìn)行特別注意。因此，有必要熟悉上述關(guān)鍵參數(shù)對載藥量的影響，以便為進(jìn)一步的ADC工藝開發(fā)獲得良好的起點(diǎn)。通過簡單地改變試劑的創(chuàng)科測量法，用抗體修飾劑對單克隆抗體進(jìn)行初始滴定，然后與藥物偶聯(lián)并分析所得ADC的DAR值，從而提供有關(guān)如何將過程引導(dǎo)至所需藥物上樣特性的寶貴信息。通常，這樣的實驗揭示了單克隆抗體修飾劑和DAR之間的關(guān)系。第一組標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件產(chǎn)生于這樣一個過程熟悉階段，允許具有可重復(fù)的預(yù)定義藥物裝載比的ADC的生產(chǎn)。

圖2：偶聯(lián)反應(yīng)前涉及抗體修飾的典型ADC工藝步驟

在熟悉階段制備的材料可以進(jìn)一步用于建立有關(guān)偶聯(lián)物穩(wěn)定性的初步數(shù)據(jù)，這當(dāng)然有助于判斷分析結(jié)果在即將到來的工藝階段的有效性，例如，當(dāng)實驗并行運(yùn)行時無法立即進(jìn)行分析研究。

【NO.3】尋找理想的工藝參數(shù)：DoE作為工具

通過熟悉階段獲得共軛過程的初步知識后，需要進(jìn)行更詳細(xì)的調(diào)查。研究反應(yīng)參數(shù)對ADC質(zhì)量屬性的影響可以設(shè)計量身定制的工藝。

可以改變的潛在大量參數(shù)使得在單個實驗中研究每種可能的反應(yīng)條件組合的方法無效。這種“一次一個因素”（OFAT）方法將導(dǎo)致進(jìn)行的實驗數(shù)量幾乎無法老化。大量的實驗會消耗寶貴的原材料，通過運(yùn)行和分析所有這些偶聯(lián)實驗來延長工藝開發(fā)階段，從而給臨床前項目帶來相當(dāng)大的成本和延誤。此外，單次實驗無法獲得參數(shù)之間相互作用的參考。因此，首選以更少的單個實驗達(dá)到相同讀數(shù)的方法。

系統(tǒng)研究過程參數(shù)的成熟且可靠的工具是所謂的“DoE”。DoE的基本原則是系統(tǒng)地規(guī)劃具有統(tǒng)計背景的實驗，允許將獲得的結(jié)果外推到未研究的參數(shù)組合。然后可以在研究的參數(shù)范圍內(nèi)計算對共軛物特性的影響。由于僅對某些統(tǒng)計選擇的組合進(jìn)行實驗分析，因此與OFAT方法相比，要進(jìn)行的實驗數(shù)量大大減少。

DoE只能用于以明確且可測量的質(zhì)量可重復(fù)地遞送偶聯(lián)物的過程。只有這樣，才能解釋參數(shù)變化與參數(shù)保持恒定的影響。在熟悉階段進(jìn)行的共軛應(yīng)該讓人相信過程本身已經(jīng)足夠穩(wěn)定，可以在DoE中進(jìn)一步研究。然后，下一個任務(wù)是選擇要調(diào)查的參數(shù)。對于大多數(shù)生物技術(shù)制造過程，例如反應(yīng)溫度和時間、蛋白質(zhì)濃度和試劑化學(xué)計量，一些選擇是顯而易見且有效的。

此外，還可以考慮反應(yīng)溶液的pH值以及緩沖鹽濃度、試劑溶液的添加時間、攪拌速率和更多參數(shù)。如前所述，定義產(chǎn)品質(zhì)量的可分析可追溯的ADC特性通常是DAR、藥物分布、單體含量、細(xì)胞殺傷活性或抗原識別。所有這些特征都可以選擇作為DoE中的輸出測量。此外，可以在單個工藝步驟的DoE中評估工藝中間體的特性，例如接頭與抗體的比率（LAR）、游離硫醇與抗體的比率（FTAR）或單體含量。至關(guān)重要的是，這些方法足夠準(zhǔn)確，可以生成可以在統(tǒng)計模型中進(jìn)一步解釋的精確數(shù)據(jù)。這意味著它們必須準(zhǔn)確無誤，散射最小，從而可以檢測到由于工藝參數(shù)變化而導(dǎo)致的產(chǎn)品質(zhì)量差異。

3.1設(shè)定實驗計劃

Design Expert、MODDE或Statistica等計算機(jī)程序為制定適當(dāng)?shù)膶嶒炗媱澮赃M(jìn)行DoE調(diào)查，以及在實驗室執(zhí)行設(shè)計實驗后的數(shù)據(jù)分析提供了巨大的幫助。對于進(jìn)入早期臨床階段的項目，參數(shù)篩選DoE通常提供有關(guān)過程的必要信息，特別是充分了解哪些參數(shù)表對過程結(jié)果有重大影響，以及這些參數(shù)的哪些值足以達(dá)到所需的產(chǎn)品特性。對于選擇的每個參數(shù)，必須選擇要研究的上限和下限。熟悉階段、相關(guān)共軛過程或文獻(xiàn)實例中的制造能力考慮和工藝經(jīng)驗塑造了所選參數(shù)空間的“角落”。

3.2 DoE的參數(shù)篩選：示例

圖3：研究賴氨酸偶聯(lián)過程

例如，在賴氨酸偶聯(lián)過程中（圖3），研究了濃度、pH值、改性劑化學(xué)計量、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間和有機(jī)助溶劑含量對LAR和單體含量的影響。選擇了參數(shù)篩選，以分?jǐn)?shù)析因設(shè)計的形式進(jìn)行參數(shù)篩選DoE。對于所有參數(shù)，定義了設(shè)定點(diǎn)以及下限（-）和較高（+）邊界。為了研究助溶劑的性質(zhì)是否對工藝結(jié)果有影響，基于兩種不同的有機(jī)溶劑定義了兩個子模塊（見表1）。

表1：由Design Expert提出的具有兩個區(qū)組和每個區(qū)組三個中心點(diǎn)的分?jǐn)?shù)階乘設(shè)計的實驗計劃

在實驗計劃中，實驗的順序是主導(dǎo)的，以避免在實驗室執(zhí)行過程中出現(xiàn)任何參數(shù)分組。此外,三個單一試驗“中心”共溶劑塊（運(yùn)行1、4、8、12、16和22在表1中）與設(shè)定值上的所有變量進(jìn)行定義，以檢查使用標(biāo)準(zhǔn)條件的過程的可重復(fù)性，并找出是否可以應(yīng)用線性模型來描述共軛過程或由于曲率的觀察。應(yīng)考慮更復(fù)雜的響應(yīng)面模型。這6次具有相同參數(shù)的運(yùn)行隨機(jī)分布在實驗計劃中。

偶聯(lián)實驗的執(zhí)行以毫克（mg）級進(jìn)行。為了對所研究的參數(shù)進(jìn)行最佳控制，需要足夠的設(shè)備。Lonza正在使用玻璃反應(yīng)器的縮小模型，因為它們用于制造套件中的臨床材料。帶夾套的10mL玻璃反應(yīng)器提供嚴(yán)格的溫度控制，并允許使用磁力攪拌棒進(jìn)行攪拌（見圖4）。為了對偶聯(lián)反應(yīng)進(jìn)行DoE研究，需要訓(xùn)練有素的技術(shù)人員或科學(xué)家，他們能夠安全地處理高效化合物。此外，分析調(diào)查需要在短時間內(nèi)進(jìn)行，因此相應(yīng)的設(shè)備、程序和人員必須隨時可用。在本研究中，選擇了兩個輸出讀數(shù)：單體含量，由尺寸排阻色譜法確定，以及抗體的負(fù)載。此外，還分析評估了溶液中偶聯(lián)物的濃度以及游離接頭的量。

圖4：Lonza Visp（羅氏）的ADC工藝設(shè)備：mg級夾套玻璃反應(yīng)器、g級玻璃反應(yīng)器、kg級不銹鋼反應(yīng)器

在收集完完整的DoE的所有數(shù)據(jù)后，在DoE軟件的支持下，分析了單參數(shù)變化的影響以及多個參數(shù)之間的相互作用。中心點(diǎn)實驗給出了使用這些標(biāo)準(zhǔn)條件的過程的可生產(chǎn)性的測量。確定了顯著影響輸出性質(zhì)的參數(shù)，在本例中為LAR以及修飾抗體的單體含量。此外，DoE方法還允許控制單個參數(shù)以及溫度和pH等參數(shù)組合的影響（見圖5）。通常，共軛過程中具有統(tǒng)計學(xué)意義的參數(shù)數(shù)量遠(yuǎn)小于研究參數(shù)的數(shù)量。這意味著只有少數(shù)參數(shù)決定了選定范圍內(nèi)共軛的成功。在ADC制造過程中，必須對這些輸入進(jìn)行良好的控制。

圖5：帕累托圖破譯了單個參數(shù)（A，B，C，...）和參數(shù)組合（AB，AC，...）對LAR的影響

除了能夠識別控制過程結(jié)果的過程參數(shù)或其組合狀態(tài)之外，DoE方法的力量還在于可以選擇根據(jù)未進(jìn)行實驗研究的值推斷過程結(jié)果。如果研究多個參數(shù)，獲得的DoE數(shù)據(jù)集可以以二維或三維圖形的形式呈現(xiàn)。如果數(shù)據(jù)支持線性模型，整個過程的統(tǒng)計模型現(xiàn)在可以識別最合適的參數(shù)集，以達(dá)到所需的輸出值。如果數(shù)據(jù)分析為基于參數(shù)變化的過程輸出的非線性行為提供了提示，則需要進(jìn)行額外的實驗來獲得描述過程的響應(yīng)面模型（有關(guān)具有曲率的數(shù)據(jù)集的示例，請參見圖6）。

圖6：mAb濃度和溫度對單體含量影響的2D圖（左）。時間和溫度與負(fù)載比的3D圖（LAR，右）

建議對開發(fā)的每個ADC進(jìn)行參數(shù)篩選，以便充分了解該過程。如果時間或資源有限，如果對不同的抗體應(yīng)用相同的偶聯(lián)技術(shù)，將一個ADC過程的DoE中獲得的信息轉(zhuǎn)置到另一個ADC過程可以提供初步指示。

【NO.4】工藝參數(shù)驗證

使用篩選參數(shù)的已識別值組合進(jìn)行驗證運(yùn)行，以驗證它們是否確實可靠地提供所需的產(chǎn)品質(zhì)量。這種“現(xiàn)實檢驗”是可取的，因為DoE提出的最優(yōu)值只是基于少數(shù)實際測試的參數(shù)組合的推斷。

【NO.5】放大至克級和純化開發(fā)

在確定了重要參數(shù)并定義并驗證了它們的設(shè)定值以達(dá)到所需的產(chǎn)品質(zhì)量后，該過程就可以從毫克級擴(kuò)大到克級了。因此，可以獲得有關(guān)過程穩(wěn)健性和可擴(kuò)展性的額外數(shù)據(jù)。在這一點(diǎn)上，探索了在準(zhǔn)備臨床材料時將使用的純化技術(shù)。

應(yīng)優(yōu)先考慮可放大的技術(shù)，例如切向流過濾（TFF）。TFF是一種濃縮和純化蛋白質(zhì)的方法。它允許高效的緩沖液交換和抗體修飾過程通常需要的小分子雜質(zhì)清除步驟。特別是，游離藥物衍生物的清除對于ADC工藝至關(guān)重要，以避免在散裝ADC最終產(chǎn)品中出現(xiàn)劇毒藥物的任何未偶聯(lián)殘留。雖然mg級工藝溶液體積通常太小，無法建立TFF等技術(shù)，但革級偶聯(lián)的體積足以正確篩選TFF參數(shù)。

在TFF系統(tǒng)中，操作參數(shù)的選擇對工藝性能有相當(dāng)大的影響。偶聯(lián)過程中TFF步驟的目標(biāo)包括優(yōu)化助焊劑，從而實現(xiàn)有效的緩沖液交換，同時獲得更好的雜質(zhì)清除率。為了實現(xiàn)可重復(fù)和優(yōu)化的工藝通量和時間，可以篩選多種膜類型和鉗子，并應(yīng)在工藝開發(fā)階段盡早優(yōu)化關(guān)鍵的TFF參數(shù)。為了快速優(yōu)化關(guān)鍵參數(shù)，在同時改變傳輸膜壓力（TMP）的同時，對不同進(jìn)料流量（FF）速率進(jìn)行第一次篩選，從而提供最大化通量速率的數(shù)據(jù)（見圖7）。

圖7：TMP和FF對TFF通量速率（左）和低分子量雜質(zhì)清除率（右）影響的示例

高通量率是首選，因為它們允許較短的 TFF 工藝時間。在確定了最佳TMP和FF后，在第二步中研究蛋白質(zhì)濃度對TFF性能的影響（參見圖7，左）。

為了確定TFF步驟中所需的透射量，需要定量目標(biāo)雜質(zhì)量的分析方法。通過分析從回收罐中取出的樣品，可以追蹤雜質(zhì)水平的降低，并確定該過程的體積量。所選的緩沖液體積需要確保這些物質(zhì)的濃度低于閾值（參見圖7，右）。

在TFF純化開發(fā)結(jié)束時，已經(jīng)確定了膜類型、FF、TMP和直徑體積數(shù)。如果發(fā)展表明TFF不是去除ADC工藝雜質(zhì)的合適技術(shù)，或者它對產(chǎn)品屬性（例如單體含量）有不易受的負(fù)面影響，則需要考慮色譜等替代策略。除非在偶聯(lián)過程中無法控制蛋白質(zhì)聚集，否則通常不需要色譜純化，這在產(chǎn)量和商品成本方面都是有利的。

【NO.6】臨床供應(yīng)

在生產(chǎn)毒理學(xué)或臨床研究材料時，必須全過程都有穩(wěn)健的生物負(fù)荷控制理念。生物負(fù)荷控制始于選擇合適的高質(zhì)量原材料供應(yīng)商，并在ADC生產(chǎn)現(xiàn)場進(jìn)行嚴(yán)格的釋放測試。安裝適當(dāng)?shù)纳a(chǎn)設(shè)備以確保盡可能封閉和無菌地運(yùn)行過程，并對工廠作員進(jìn)行嚴(yán)格的生物負(fù)荷意識培訓(xùn)，進(jìn)一步降低了ADC批次的污染風(fēng)險。通過過程控制在整個過程中跟蹤內(nèi)毒素水平和生物負(fù)荷，可以提供有關(guān)潛在污染源的額外數(shù)據(jù)和專業(yè)知識。此外，定義生物負(fù)荷減少步驟（例如過程中的0.2μm過濾）對于避免不必要的風(fēng)險至關(guān)重要。通常，ADC過程從將吸收器轉(zhuǎn)移到封閉的反應(yīng)容器中開始。反應(yīng)時間延長后，可能需要額外的工藝過濾。當(dāng)然，在儲存配制的ADC溶液之前，將進(jìn)行最終填充過濾。此外，緩沖液可能會在生產(chǎn)和/或使用點(diǎn)進(jìn)行過濾，并且需要嚴(yán)格評估這些溶液的可接受儲存時間和溫度。

在使用DoE參數(shù)篩選方法定義工藝參數(shù)和純化開發(fā)，然后定義生產(chǎn)概念后，該工藝可以放大到通常>50g的規(guī)模，使生產(chǎn)材料能夠支持毒性研究和早期臨床階段。在不同批次上應(yīng)達(dá)到可重復(fù)的產(chǎn)品質(zhì)量，這與實驗室早期獲得的材料相同。

【NO.7】實現(xiàn)商業(yè)化工藝的挑戰(zhàn)

當(dāng)一個過程進(jìn)入臨床階段時，必須對其進(jìn)行進(jìn)一步的表征，以便最終通過驗證，這是生產(chǎn)用于商業(yè)供應(yīng)的ADC的必要條件。在所謂的工藝設(shè)計階段，未來商業(yè)過程的參數(shù)是根據(jù)額外的實驗室經(jīng)驗和通過早期臨床階段ADC制造的擴(kuò)大活動獲得的知識來定義的。在工藝生命周期的這一階段，DoE方法再次允許通過相當(dāng)有限的實驗數(shù)量獲得深入的工藝知識。

在通過初始因子篩選確定了重要的工藝參數(shù)以確保所需的產(chǎn)品質(zhì)量后，可以在更全面的DoE的“工藝設(shè)計”階段進(jìn)一步優(yōu)化這些因素。如果需要，可以使用非線性系統(tǒng)的響應(yīng)面模型進(jìn)一步研究在初始篩選DoE中觀察到的輸出曲率。因此，可以建立一個模型來準(zhǔn)確描述共軛過程的行為，并可視化所有相關(guān)變量的相互作用。這允許為工藝參數(shù)定義設(shè)計空間。在設(shè)計空間的邊界內(nèi)，流程按預(yù)期執(zhí)行。這可以通過證明共軛過程穩(wěn)健性的其他實驗來驗證。這些調(diào)查導(dǎo)致確定關(guān)鍵工藝參數(shù)（CPP）并定義所有相關(guān)工藝參數(shù)的經(jīng)驗證的可接受范圍（PAR），必須遵循這些范圍，以便實現(xiàn)批次之間同等質(zhì)量的ADC生產(chǎn)。

由于與早期臨床階段相比，商業(yè)化生產(chǎn)的變化通常涉及進(jìn)一步的擴(kuò)大規(guī)模，因此應(yīng)考慮對產(chǎn)品質(zhì)量的任何潛在影響。例如，通過攪拌輸入的功率、攪拌器的尖端速度和添加試劑后達(dá)到均勻性的時間幾乎不能保持恒定。因此，必須確保為這些變量選擇的值不會影響任何ADC正確的連接。如果接觸材料在進(jìn)一步放大過程中發(fā)生變化，則可能需要進(jìn)行額外的實驗室調(diào)查，以證明它們與工藝流的兼容性。此外，過濾器尺寸實驗有助于為商業(yè)工藝選擇合適的0.2μm過濾器尺寸。憑借收集到的所有信息和通過制造過程獲得的深厚知識，ADC現(xiàn)在可以大規(guī)模生產(chǎn)用于商業(yè)應(yīng)用。

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