摘要：流感病毒具有高度變異性，這是導致流感疫苗保護率較低的主要原因，其保護率僅在 20%~60% 之間。因此，開發新型疫苗以應對流感病毒的變異十分必要。mRNA 流感疫苗的生產基于體外轉錄（in vitro transcription, IVT）技術的無細胞制造體系，該體系能大幅降低生物安全風險，且疫苗具有免疫原性高、生產周期短等優點，使其可快速響應流感病毒的變異，已成為新型流感疫苗的研發熱點之一。本文就 mRNA 疫苗歷史及現狀、mRNA 流感疫苗的研究進展作一綜述，以期為流感疫苗的迭代升級與廣譜保護策略提供科學依據。

與 DNA 疫苗不同，mRNA 疫苗可在細胞質中直接表達抗原，無需進入細胞核。這一特性不僅降低了藥物遞送難度（無核定位步驟），還可規避基因組整合風險，從機制上消除了插入突變的可能性。mRNA 疫苗的生產基于體外轉錄（IVT）技術的無細胞制造體系，能大幅降低生物安全風險（如避免宿主細胞污染），生產周期也縮短至傳統疫苗的 1/3。

mRNA 疫苗的核心優勢在于 “即插即用” 的模塊化平臺設計，通過替換抗原編碼序列（如流感病毒的血凝素（haemagglutinin, HA）和神經氨酸酶（neuraminidase, NA）基因）即可快速開發新疫苗，脂質納米顆粒（lipid nanoparticles, LNPs）封裝等核心工藝無需調整，顯著提升了疫苗研發的延展性。另外，通過多抗原混合遞送（如復合 LNP 制劑）或基因融合技術（串聯多表位序列）可構建覆蓋多種變異株的多價疫苗，使針對流感病毒的廣譜保護效率提升 2~3 倍。在免疫激活層面，mRNA 疫苗可同時激發雙通道免疫應答，既可通過分泌型抗原誘導 B 細胞產生中和抗體，又可通過主要組織相容性復合體 -Ⅰ（Major Histocompatibility Complex-Ⅰ, MHC-Ⅰ）類分子遞呈內源性抗原，激活強效 CD8+T 細胞反應。這種協同作用使其免疫保護率較傳統流感疫苗（依賴單一體液免疫）大幅提高，特別是在應對快速變異的流感病毒株時，可展現出獨特優勢。

1 mRNA 疫苗的發展與現狀

20 世紀 80 年代，有研究證明，外源 mRNA 可在細胞內表達特定蛋白，并引起免疫反應；隨后，有研究開發了一種基于 mRNA 的人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus, HIV）疫苗，但免疫小鼠后，引發了嚴重的炎性反應；2005 年，該疫苗的研發者將尿嘧啶替換為假尿嘧啶，降低了 mRNA 本身引起的免疫反應，該發現獲得了 2023 年諾貝爾生理學或醫學獎。2020 年，SARS-CoV-2 在全球范圍內流行，確定病毒序列后，德國 BioNTech 及美國 Moderna 等多家公司迅速研發了 SARS-CoV-2 mRNA 疫苗，其中，德國 BioNTech 公司研發的 SARS-CoV-2 mRNA 疫苗產品 BNT162b2 于 2020 年 12 月獲得緊急使用授權，2021 年 8 月全面批準上市，成為全球第 1 款獲批上市的 mRNA 疫苗產品；隨后美國 Moderna 公司生產的 SARS-CoV-2 mRNA 疫苗產品 mRNA-1273 也獲得了緊急使用授權。2023 年 3 月，石家莊石藥控股集團有限公司的 SARS-CoV-2 mRNA 疫苗 SYS6006 在中國納入緊急使用，這是第一款我國企業自主研發，并在國內獲得緊急授權使用的 SARS-CoV-2 mRNA 疫苗。

mRNA 疫苗也適合其他傳染病疫苗的研發，如呼吸道合胞病毒、流感病毒等，還可用于治療多種疾病，如編碼血管內皮生長因子的 mRNA 可用于治療心血管疾病；編碼能產生細胞因子功能蛋白的 mRNA 可用于重塑腫瘤微環境并恢復免疫適應性，編碼腫瘤相關抗原的 mRNA 可用于腫瘤的治療，包括黑色素瘤、卵巢癌、乳腺癌等。

1.1 mRNA 疫苗的序列設計

mRNA 由 5'- 帽子、非翻譯區（untranslated region, UTR）、編碼序列區（coding sequence region, CDS）和多聚腺苷酸尾 poly (A) 組成，這些基本結構域均可影響 mRNA 的穩定性、免疫原性和翻譯效率。人工合成未經修飾的 mRNA 存在穩定性差、翻譯效率低、自身免疫劇烈等問題，阻礙了其臨床應用。針對 mRNA 序列的優化和設計已取得一定進展，如將尿嘧啶替換成假尿嘧啶可降低 mRNA 免疫原性，顯著提高翻譯效率；核苷類似物 N6 - 甲基腺嘌呤核苷、5 - 甲基胞苷三磷酸等也可進一步降低 mRNA 自身的免疫原性。

mRNA 的 UTR 可分為 5'UTR 和 3'UTR，分別位于編碼區的兩端。UTR 可通過與 RNA 結合蛋白相互作用影響轉錄本的翻譯速率和半衰期，因此，UTR 的優化對 mRNA 疫苗設計尤為重要。非洲爪蟾或人類 α- 珠蛋白及 β- 珠蛋白的 UTR 具有高度穩定性，已成為 mRNA 疫苗常用的 UTR；也可通過生物信息學方法設計 UTR 序列，如德國 BioNTech 公司研發的 SARS-CoV-2 mRNA 疫苗 BNT162b2 的 3'UTR 是通過篩選 Split 蛋白氨基端增強子 / Split 轉導樣增強子 5（amino-terminal enhancer of split/transducin-like enhancer of Split 5, AES/TLE5）基因和人線粒體 12S rRNA 的 3'UTR 序列，并將兩者結合后構建而成；美國 Moderna 公司研發的 mRNA-1273 疫苗也是采用優化后的 UTR 構建而成，有效率高達 94.5%，該公司還開發出針對特定編碼區設計定制化 UTR 的算法，僅用 2 小時即可設計出完整的疫苗 mRNA 序列；SAMPLE 等采用生物信息學方法建立了一個基于隨機 5'UTR 庫的預測模型，該模型可設計新的 UTR 序列，并預測其翻譯效率，可提高 mRNA 的翻譯效率，延長半衰期。另外，mRNA 疫苗的調控元件 5'- 帽子為 7 - 甲基鳥苷（7-methy-lguanosine, m7G），通過 5',5'- 三磷酸橋與 5' 端第 1 個核苷酸項鏈添加至 mRNA 上，具有招募核糖體和促進翻譯的功能；Poly (A) 尾為 3' 末端多聚腺苷酸化部分，具有調控 mRNA 穩定性和蛋白質翻譯效率的功能。

目前，mRNA 疫苗主要為線性 mRNA，可分為非復制型 mRNA（non-replicating mRNA）和自擴增型 mRNA（self-amplifying mRNA），前者是利用細胞機制翻譯相應蛋白質；后者既可編碼抗原，也包含編碼 mRNA 自我復制的輔助蛋白，包括 RNA 聚合酶、加帽酶、蛋白酶等。大多數參與 mRNA 降解的核糖核酸酶具有 5' 或 3' 端依賴活性，因此，線性 mRNA 的穩定性較低。環狀 mRNA（circRNA）具有共價閉合的環形結構，可保護自身免受核酸酶的降解，穩定性更好，半衰期更長，解決了線性 mRNA 穩定性較低的問題。

1.2 mRNA 疫苗的遞送方法

mRNA 高效、安全的遞送是成功開發 mRNA 疫苗的關鍵環節。mRNA 帶負電荷，在血液中會被核酸酶迅速降解，無法通過同樣含有負電荷的磷脂雙分子層進入細胞內。因此，需采用載體將 mRNA 遞送至靶細胞。目前，已開發多種材料用于 mRNA 遞送，包括脂質、類脂材料、聚合物和蛋白質衍生物。

LNPs 是最常見的 mRNA 遞送系統，具有較大負載量、較高穩定性和生物相容性，LNPs 通常由 4 種成分組成，包括可電離的陽離子脂質、輔助磷脂、膽固醇和聚乙二醇脂質。常見的陽離子脂質有 N-[1 (2,3 - 二油酰氧基) 丙基]-N,N,N - 三甲基氯化銨（N [1-(2,3-dioleoyloxy) propyl]-N,N,N-trimethylammonium chloride, DOTMA）和二亞油酰甲基 - 4 - 二甲氨基丁酸酯（dilinoleoyl-methyl-4-dimethylaminobutyrate, Dlin-MC3-DMA），陽離子脂質能夠介導 LNPs 與細胞漿或內體膜間的靜電相互作用，促進 mRNA 的細胞內化；常見的磷脂有 1,2 - 二硬脂酰 - sn - 丙三基 3 - 磷酸膽堿（1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DSPC）和 1,2 - 二油酰基 - sn - 丙三基 3 - 磷酸乙醇胺（1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, DOPE），位于 LNPs 的外圍，有助于包裹核酸，穩定 LNPs；聚乙二醇（polyethylene glycol, PEG）脂質由 PEG 與錨定脂質結合而成，如 DSPE-PEG 2000，為 LNPs 提供了外聚合物層，可阻礙血清蛋白和單核吞噬細胞系統的吸附，延長體內循環時間；膽固醇是一種天然存在的脂質，在 LNPs 制劑中，膽固醇占總脂質的 20%~50%，可通過填充脂質之間的空隙增強納米顆粒的穩定性，從而提高 mRNA 遞送效率。mRNA-1273 和 BNT162b2 疫苗均采用 LNPs 作為遞送載體。

2 mRNA 流感疫苗的研究進展

流感病毒屬于流感病毒屬正黏病毒科，為分節段負鏈 RNA 病毒，由 8 個 RNA 片段組成。根據核蛋白和基質蛋白可分為甲、乙、丙、丁 4 個亞型。甲型流感病毒根據 HA 和 NA 的抗原性，可進一步分為多個亞型，如 H1N1、H3N2；乙型流感病毒僅分為 Yamagata（B/Victoria lineage, BV）和 Victoria（B/Yamagata lineage, BY）兩個抗原區分譜系。mRNA 疫苗技術具有生產周期短，不依賴雞胚，安全性高等優點。目前，mRNA 流感疫苗成為研發熱點，已有多款 mRNA 流感疫苗處于臨床試驗或臨床前階段，如下表所示：

2.1 季節性 mRNA 流感疫苗

美國 Moderna 公司研發的四價季節性流感疫苗 mRNA-1010（Fluarix）可編碼 4 種流感病毒表面 HA 蛋白，分別為 H1N1、H3N2、BY 和 BV，Ⅲ 期臨床試驗數據顯示，該疫苗對甲型流感病毒具有較高的中和抗體滴度，而對乙型流感病毒的中和抗體滴度較低，且在老年人中的免疫原性較低；更改劑型后，對 4 種亞型 H1N1、H3N2、BY、BV 均可產生更高的中和抗體滴度。另外，美國 Moderna 公司正在開發的流感疫苗 mRNA-1011 及 mRNA-1012 包含了更多型別的 HA 抗原，以擴大血清型的覆蓋，mRNA-1020 和 mRNA-1030 疫苗中增加了 NA，以改善免疫響應，減少病毒抗原逃逸的可能性。

法國 Sanofi/TranslateBio 公司研發了一種編碼 H3N2 HA 蛋白的單價 mRNA 流感疫苗，Ⅰ 期臨床試驗數據顯示，第 2 次注射 2 周后，各劑量組血清陽轉率在 91%~100% 之間。美國 Pfizer 與德國 BioNTech 公司聯合開發的四價修飾 mRNA 流感疫苗 Ⅲ 期臨床試驗數據顯示，該疫苗在 65 歲以上人群中可引起更強的 CD4 + 與 CD8+T 細胞免疫反應。

2.2 通用 mRNA 流感疫苗

流感病毒具有高突變性，可通過開發通用疫苗加以應對，如采用病毒保守表位設計抗原，使疫苗免受抗原漂移和轉換的影響，為季節性流感提供更廣泛的保護。

南方科技大學醫學院通過對流感病毒 HA、NA、NP 和 M2 4 種抗原的全序列檢索、比對，尋找保守序列，獲得了由保守序列組成的 T、B 細胞表位和 MHC 表位，設計了包含多種保守表位的潛在通用 mRNA 疫苗，基于免疫信息學分析，該通用型 mRNA 多表位疫苗可能對 A 和 B 型流感各亞型具有保護潛力。美國賓夕法尼亞大學研究開發了一種針對所有 20 種已知流感病毒亞型的 mRNA 實驗性疫苗，該疫苗編碼來自所有 20 種已知甲型流感病毒亞型和乙型流感病毒譜系的 HA 抗原。這種多價疫苗在小鼠和雪貂體內引起了高水平的交叉反應性和亞型特異性抗體。這些抗體對所有 20 種編碼抗原均有反應，能夠提供廣泛保護性作用，有望成為預防未來流感大流行的通用措施。NIAID 研發的廣譜通用型 mRNA 流感疫苗 FluMos-v1 納米顆粒表面嵌入了多種流感病毒的 20 多個 HA 片段，Ⅰ 期臨床試驗結果顯示，可刺激機體產生針對幾種不同毒株流感病毒的抗體。上海生物制品研究所有限責任公司基于生物信息學分析，選擇在不同亞型流感病毒中高度保守的保護性抗原及其結構域，設計了可融合表達流感病毒 M2e 串聯序列、HA 莖部區域長 α 螺旋（long alpha helix, LAH）串聯序列和病毒 NP 抗原的組合策略，開發出一款新型廣譜流感 mRNA 疫苗，該疫苗可誘導廣泛的體液和細胞免疫反應。

綜上所述，通用流感疫苗的開發有許多途徑，如構建保守的 T、B 細胞表位流感疫苗或有針對性加入額外抗原構建多價流感疫苗，這些途徑可通過 mRNA 技術輕松實現。

3 挑戰及應對措施

mRNA 流感疫苗對抗流感流行具有極大潛力，但進入實際應用仍有問題急需克服，如抗原逃逸及疫苗穩定性等。

由于流感病毒的高突變性，流感疫苗常出現疫苗株與流行株不匹配的現象。對下一代疫苗進行合理設計，以最大限度提高疫苗的保護率，是流感疫苗需要解決的問題。一方面可通過上述多種途徑開發通用 mRNA 流感疫苗，如多價、T 細胞靶向的流感疫苗，對多種流感病毒提供更廣泛、持久的保護；另一方面可通過生物信息學方法更準確地預測流行株，減少疫苗逃逸現象。

由于 mRNA 具有不穩定性，mRNA 疫苗均需較高的冷凍儲存和運輸（-70℃）條件，在一定程度上限制了 mRNA 流感疫苗的應用，提高 mRNA 熱穩定性可在一定程度上解決該問題。從制劑入手，可將 mRNA 疫苗制備為凍干制劑，如深圳瑞吉生物科技有限公司研究開發的凍干 LNP-mRNA，即 SARS-CoV-2 疫苗 RH109，可于室溫（25℃）長期儲存。從 LNPs 配方入手，可對 LNPs 進行改造和工藝優化，以提高 mRNA 疫苗的穩定性；也可從序列入手，通過去除 HA 抗原的頭部，保留更保守的莖部區域，還可通過截短抗原序列，縮短 mRNA 長度，以提高 mRNA 的穩定性。蘇州艾博生物科技有限公司研發的 SARS-CoV-2 mRNA 疫苗 ARCoV，使用 S 蛋白的受體結構域（receptor binding domain, RBD）結構域，僅長 669 bp，該疫苗于 4 和 25℃條件下至少可保存 1 周。為獲得穩定性更高的 mRNA 疫苗，需對上述因素進行綜合考慮。

4 小結及展望

mRNA 流感疫苗具有替代傳統疫苗的巨大潛力，其研發周期短、生產流程簡便、易于針對病毒變異株快速更新。目前，多款 mRNA 流感疫苗已進入臨床試驗階段，初步數據顯示，其能夠誘導強烈的體液和細胞免疫反應，保護效果可能優于傳統滅活疫苗。但 mRNA 流感疫苗的廣泛應用仍面臨多個挑戰，如在穩定性、安全性及遞送效率等方面仍需改進。另外，生產成本優化和公眾對新技術接受度的提升也是 mRNA 疫苗廣泛應用的關鍵。相信在不久的將來，mRNA 流感疫苗會獲批上市，成為預防流感更有效的手段。

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