近日，山東省農業科學院作物研究所李根英研究員領銜的小麥分子育種創新團隊在《科學通報》發表了題為“敲除pina和pinb基因提高小麥籽粒硬度”的研究論文。

小麥是世界三大糧食作物之一，是人類食物的主要來源。隨著經濟的日益增長和人民生活水平的不斷改善，人們對面制品加工品質要求越來越高，優質專用小麥品種的需求越來越大，小麥品質改良成為主要育種目標。籽粒硬度是決定小麥加工品質最重要的性狀之一，對小麥出粉率、淀粉損傷和面粉的吸水率以及谷物加工品質具有重要的影響。小麥籽粒硬度主要是由位于5D染色體的兩個Pin基因決定的，包括Pina和Pinb基因，它們的編碼區均為447 bp，沒有內含子，共同形成了小麥籽粒硬度的分子遺傳基礎。pina-D1a/pinb-D1a是普通野生型小麥中最常見的基因型，有一個基因發生突變都會導致籽粒變硬。硬度基因在我國普通小麥中存在多種變異類型，有pina突變導致PINA蛋白缺失，有pinb變異使核苷酸產生突變，種種變異類型都導致了胚乳硬度增加，進而使籽粒硬度變大。目前，已經發現的Pin等位基因有很多，除了pina缺失之外，其他都屬于單堿基突變，而含有這些突變類型的小麥材料，大多數的籽粒硬度都是相似的，SKCS硬度指數處于40-60之間，很難滿足優質面包生產對籽粒硬度和面粉吸水率的要求。

基于CRISPR/Cas9的基因組編輯技術的出現，為小麥提供了快速、準確地創造更多新基因資源的機會。CRISPR/Cas9 技術具有載體構建相對簡單、靶向特異性高、而且可以多處打靶等特點，已經在多個物種中成功實現了定點基因組編輯。小麥是異源六倍體，基因組龐大，重復序列和基因拷貝數非常多，近幾年逐步建立了高效小麥遺傳轉化和基因編輯體系，對很多控制重要性狀的基因進行了遺傳修飾，在提高產量、改良抗病、抗逆性方面創制了一批具有潛在應用價值的新材料。

本研究利用CRISPR/Cas9基因編輯技術，對pina和pinb基因進行敲除，根據sgRNA設計原則每個基因選擇了2個sgRNA。以冬小麥品種K35為轉化受體，分別構建了單基因和雙基因編輯載體，通過農桿菌介導的小麥遺傳轉化獲得了基因編輯植株。利用Hi-TOM高通量測序法對T0、T1和T2代植株進行連續的篩選和鑒定，獲得了pina、pinb基因的單突變體及雙突變體。用Sanger測序法進一步鑒定了純合植株，得到了籽粒硬度提升的小麥新種質，但是沒有影響植株生長和其它農藝性狀。利用掃描電鏡觀察野生型和突變體籽粒顯微結構的差異，不同硬度的籽粒結構是有差異的，突變體中的淀粉顆粒與蛋白質基質二者之間結合更加緊密。為了解析pina和pinb基因影響小麥籽粒硬度的分子機制，利用轉錄組測序篩選出差異表達的基因，并進行了GO和KEGG pathway的富集分析，GO功能分類主要富集到生殖發育過程、胚胎發育、種子發育、生殖結構發育等，KEGG富集基因主要集中在MAPK信號通路、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝、半乳糖代謝、油菜素內酯生物合成等過程。這說明小麥籽粒硬度的形成和變化不是一個單一的過程，影響了多個代謝通路和途徑。

圖1基因編輯載體構建

本課題組在前期工作中利用農桿菌介導的CRISPR/Cas9系統對pinb基因進行精準打靶，獲得了具有新優異等位基因的小麥新種質，其中春麥品種fielder的SKCS指數由18.2提高到73.4，顯著提高了其籽粒硬度，一步將軟質小麥變成了硬質小麥。該突變在編碼區發生了34bp的缺失，是迄今為止在普通小麥pinb基因中出現的第一個大片段缺失材料，拓寬了小麥籽粒硬度改良的遺傳資源。但對于pina基因敲除的材料至今未見報道。不僅如此，上述研究中使用的受體是春性材料，很難作為育種親本應用于冬小麥的新品種培育。因此，本研究以冬小麥K35作為受體材料，利用CRISPR/Cas9基因編輯技術分別對pina和pinb基因進行定點敲除，獲得pina、pinb的單基因和雙基因突變體，創制了具有新型等位變異的優異種質材料，為研究小麥籽粒硬度形成的遺傳和生化基礎提供寶貴材料，為我國在籽粒硬度研究方面提供準確信息，為選育優質專用小麥提供種質資源，對其功能研究和小麥品質改良均具有重要意義。

圖2 基因表達及籽粒硬度檢測

文章信息

張淑娟，高潔，楊路瑤，等。敲除pina和pinb基因提高小麥籽粒硬度. 科學通報, 2025, 70 (16): 2588-2600. 2025-05-07.

https://doi.org/10.1360/TB-2024-1290

轉載、投稿請留言

| 關注科學通報 | 了解科學前沿