科學家按下基因進化的“超級加速鍵”，過去自然界中需要數萬年甚至更久的基因突變和進化過程，現在只需要 1 天就能完成了。

最近，清華大學陳國強教授團隊開發了一種突破性的定向進化技術——“正交轉錄突變系統”（orthogonal transcription mutation system）。該系統能夠加速對目標基因的進化過程，具有突變效率高、特異性高、突變范圍廣、宿主兼容性強和使用簡便的特點。

值得關注的是，該系統在非模式生物中突變率提升超過 150 萬倍。研究人員應用該系統在單日誘變周期內快速進化了熒光蛋白、色素蛋白、細胞骨架蛋白、細胞分裂相關蛋白、全局轉錄因子及 LysE 轉運蛋白。這意味著，原本需要數周甚至數月迭代進化才能獲得的理想效果，現在僅需 1 天即可實現。

圖丨邵明威（來源：邵明威）

通過將脫氨酶與噬菌體 RNA 聚合酶融合，該系統能夠在目標基因中均勻引入 C：G 到 T：A 和 A：T 到 G：C 的突變，同時保持較低的脫靶效應。研究團隊對該工具的特異性進行檢測，發現它能夠針對特定的目標基因產生高頻突變，對其他基因的干擾很小，從而保證了高特異性。

多個基因測試結果顯示，該系統在超過幾千個堿基對的長度上也能產生大量突變，展現出廣泛的突變范圍。此外，該系統實現了兼容不同生物體系——不僅適用于大腸桿菌為代表的模式生物，也適用于以嗜鹽單胞菌 Halomonas bluephagenesis 為代表的極端微生物。

在基礎研究領域，該系統為蛋白質功能研究提供了全新的工具。它不僅能快速鑒定關鍵氨基酸位點、解析催化機制，更重要的是可以建立蛋白質進化過程中序列與功能之間的映射關系，從而加速對蛋白質進化機制的理解。

在工業應用方面，該系統展現出廣闊的前景。首先，在藥物研發領域，可對制藥相關蛋白、酶或抗體進行高效突變，既能加速藥物生產流程，又能優化抗體功能。其次，在綠色生物制造方面，通過改造微生物對纖維素水解液、乙酸等非常規碳源的利用基因，可顯著提高資源利用效率。更重要的是，該系統能大幅提升工業酶的催化活性，從而優化整個生產流程的效率。

目前，該團隊已與合成生物學公司微構工場合作，利用正交轉錄突變系統對聚羥基脂肪酸酯（PHA，Polyhydroxyalkanoates）合成的關鍵基因進行突變和進化，旨在通過提高 PHA 的合成效率，為 PHA 工業放大生產奠定基礎。

審稿人對該研究評價稱：“總體而言，這項研究基于 MmP1、K1F 和 VP4 RNA 聚合酶建立了正交轉錄介導的連續進化系統。該研究設計嚴謹、方法可靠，為構建高效生物催化系統提供了切實可行的解決方案。”

近日，相關論文以《一種用于加速體內蛋白質進化的正交轉錄突變系統，可產生所有轉換突變》（An orthogonal transcription mutation system generating all transition mutations for accelerated protein evolution in vivo）為題發表在Nature Communications[1]。清華大學博士生邵明威是第一作者，陳國強教授擔任通訊作者。

圖丨相關論文（來源：Nature Communications）

理想的“五合一”蛋白進化系統：效率高、特異性高、突變范圍廣、宿主兼容性強和使用簡便

蛋白質的進化和優化在生物制藥、工業生物技術和合成生物學等領域具有重要意義。然而，傳統蛋白進化方法在效率、宿主兼容性或突變范圍大小等方面存在局限性，特別對于鹽單胞菌這種非模式生物而言，目前仍然缺乏高效優化蛋白質功能的工具。

首先，體外突變方法（如易錯 PCR 等）雖然能夠構建突變體文庫，但整個過程周期較長，通常需要數周甚至數個月才能完成文庫構建和宿主細胞轉化。此外，這類方法嚴重依賴轉化效率，尤其是當目標 DNA 片段較大時，轉化效率會大幅下降，這會導致最終導入宿主細胞的突變體數量有限，從而降低篩選到目標突變體的概率。

其次，現有的體內進化方法雖然避免了體外轉化的限制，但仍存在諸多不足。例如，美國哈佛大學劉如謙教授實驗室開發的噬菌體輔助連續進化系統（PACE）雖然高效，但系統搭建復雜，且僅適用于特定蛋白質的進化。

類似地，基于正交 DNA 復制的突變系統通常局限于特定宿主，難以遷移至新其他宿主中；而基于 T7 RNA 聚合酶的突變工具在非模式生物（如假單胞菌、嗜鹽單胞菌）中效率較低，甚至完全失效。此外，基于 CRISPR-Cas 的突變系統通常僅能在特定位點引入突變，無法覆蓋整個基因或基因簇。

基于這些挑戰，研究團隊認為，一個理想的蛋白進化系統應具備以下特點：首先，突變效率高，能夠在短時間內完成突變過程；其次，突變特異性高，僅針對目標基因產生突變，不影響其他基因的功能；第三，突變范圍廣，能夠覆蓋整個目標基因或基因簇，而不僅僅局限于單個堿基；第四，宿主兼容性強，能夠在不同宿主細胞（包括模式和非模式生物）中使用，具有廣泛的兼容性；最后，使用簡便，無需復雜的儀器設備即可完成突變進化。

核心機制：脫氨酶融合噬菌體 RNA 聚合酶實現精準突變

正交轉錄突變系統的核心在于，將 MmP1、K1F 和 VP4 這三種本身具有廣宿主兼容性的噬菌體 RNA 聚合酶與脫氨酶進行融合。

這一巧妙設計實現了兩個關鍵功能的協同作用：RNA 聚合酶主要負責識別對應的啟動子，進而啟動下游基因的轉錄過程，此時雙鏈 DNA 會解旋成單鏈；脫氨酶可以對暴露的單鏈 DNA 區域進行突變，通過組合不同類型的脫氨酶可實現 C：G 到 T：A 和 A：T 到 G：C 兩種堿基突變。

實驗顯示，產生 C：G 到 T：A 突變的 pMT2-MmP1-W 突變效率比對照組提高 150 萬倍，而 pMT23opt-MmP1 可同時引入 C：G 到 T：A 和 A：T 到 G：C 突變，日均突變率達 2.64 次/千堿基，遠超此前技術。

邵明威對 DeepTech 解釋說道：“該系統的優勢體現在精準可控，當轉錄過程終止時突變也會同步停止，從而保證了對特定基因和區域的突變。并且，這種基于噬菌體 RNA 聚合酶與啟動子特異性識別的機制，賦予了系統極高的突變特異性。”

（來源：Nature Communications）

在構建雙類型突變系統的過程中，研究團隊采用了三種不同的設計策略。首先，針對兩種功能不同的脫氨酶（胞嘧啶脫氨酶可產生 C：G 到 T：A 類型的突變；腺嘌呤脫氨酶則能產生 A：T 到 G：C 類型的突變），他們設計了兩種融合順序相反的突變系統：一種采用“胞嘧啶脫氨酶-腺嘌呤脫氨酶-RNA 聚合酶”的串聯結構，另一種則采用“腺嘌呤脫氨酶-胞嘧啶脫氨酶-RNA 聚合酶”相反順序。

此外，他們還開發了第三種系統——在單個質粒中同時表達“腺嘌呤脫氨酶-RNA 聚合酶”和“胞嘧啶脫氨酶-RNA 聚合酶”突變元件。

“在構建第三種突變系統的過程中，我們對其中一個 RNA 聚合酶的序列進行了密碼子優化，這樣能夠有效避免因 RNA 聚合酶基因序列高度相似而導致的同源重組問題。”邵明威說。

（來源：Nature Communications）

這項歷時近三年的研究過程充滿了挑戰。都說“萬事開頭難”，研究初期在構建突變檢測系統時就遇到了長達半年的瓶頸期。該團隊最初嘗試在嗜鹽單胞菌中將脫氨酶與 RNA 聚合酶融合來驗證概念可行性，但如何準確評估突變效率成為關鍵難題。

常規的抗生素抗性基因檢測方法在實驗使用的非模式菌株（嗜鹽單胞菌）中面臨重大挑戰——該菌株天然對卡那霉素、氨芐霉素和鏈霉素等多種抗生素具有抗性。

為此，研究人員在前期構建突變檢測系統時，篩選了大量候選抗生素與抗性基因。邵明威表示：“經過不斷篩選，與陳國強老師交流以及和實驗室其他同學討論，我們最終發現基于紅霉素抗性基因是有效的檢測方案。”

（來源：Nature Communications）

研究過程中遇到的另外一個難題是突變在目標基因上分布不均勻。在系統優化階段，研究人員發現突變存在明顯的區域偏好性，主要集中在啟動子附近區域，這種不均勻分布嚴重影響了蛋白質的全面優化。

通過大量文獻調研和深入思考，邵明威嘗試通過在目標基因的上下游同時插入招募突變系統的啟動子。這一改進使突變數目顯著增加，且分布更加均勻。“在技術瓶頸期持續探索后，突然找到解決方案的那一刻，有種豁然開朗的感覺。”邵明威回憶道。

計劃 1 年內落地產業化，推動綠色生物制造

陳國強教授是中國首位獲得國際代謝工程獎的合成生物學專家，其團隊長期致力于合成生物學和微生物代謝工程研究，尤其專注于利用合成生物學技術對極端微生物鹽單胞菌（Halomonas）進行系統性遺傳改造。

鹽單胞菌作為一類從高鹽環境（2.5M NaCl）中分離鑒定的特殊微生物，具有耐鹽堿、抗污染等獨特的極端環境適應特性。基于這些特性，該團隊在國際上創新性地提出了“以鹽單胞菌為底盤細胞的下一代工業生物技術”發展戰略。

該技術路線包含三個關鍵環節——開發高效的蛋白質定向進化工具，重構代謝網絡以及優化發酵控制參數，最終目標是實現 PHA、四氫嘧啶、重組蛋白等高附加值生物產品的規模化生產。

在具體實施過程中，他們特別重視關鍵功能基因的定向進化，例如通過對 PHA 合成酶基因簇的系統性優化，顯著提升其催化效率和底物利用范圍等核心性能指標，從而大幅提高了目標產物的產量和品質。

嗜鹽菌作為“下一代工業生物技術”核心底盤，可在開放無滅菌條件下低成本生產 PHA、四氫嘧啶等高值產物，但此前缺乏高效的蛋白質定向進化工具。團隊在本次研究中開發的正交轉錄突變系統具有顯著的模塊化和可擴展性特征。該系統可靈活應用于任何目標基因的改造。舉例來說，在生物制造過程中，若發現某個關鍵酶的活性不足導致產物產量受限，即可利用該系統對相關酶進行快速突變優化。

圖 | 微構工場透明發酵罐（來源：微構工場）

在技術轉化方面，陳國強此前還聯合發起成立了合成生物學企業微構工場。該公司是一家在生物制造前沿領域極具創新影響力的科技公司，通過嗜鹽微生物的改造和工程化應用，進行綠色高分子生物材料 PHA 的研發和制造。

此次關于正交轉錄突變系統的研究成果，與 PHA 材料密切相關。該系統可高效優化參與 PHA 合成的關鍵酶，提升其活性和穩定性，從而提高 PHA 的產量和質量。

同時，通過改造生產 PHA 的微生物菌株，增強其合成能力，有望降低成本并拓展 PHA 在生物可降解塑料和醫用材料等領域的應用，為 PHA 材料的高效生產提供了有力支持。

目前，實驗室正與微構工場開展深度合作，預計經過實驗室小規模驗證后，計劃在 1 年內推進研究成果的工業化放大。得益于微構工場完備的發酵設備體系（從實驗室規模的幾升發酵罐到工業化生產的數百乃至上千升發酵系統），實驗室研發的高活性蛋白質突變體或優化菌株可直接進行規模化生產驗證，實現從基礎研究到產業應用的快速轉化。

圖 | 微構工場百升發酵罐（來源：微構工場）

值得注意的是，在微生物突變篩選的初期階段，并不需要進行大規模發酵，僅需幾十毫升的培養瓶即可開展工作。由于細菌培養密度極高（>10? cells/mL），幾毫升搖瓶培養就能構建大規模的突變體文庫并進行高效篩選，待獲得理想突變體后再進行放大驗證。

針對放大過程中可能面臨的發酵穩定性問題，團隊認為可將優化后的突變基因整合到細菌染色體上。這種染色體整合策略有效避免了傳統質粒系統（依賴抗生素維持且易丟失）的缺陷，確保了工業化生產的穩定性。具體操作流程包括：先將突變基因整合至染色體，再進行發酵驗證和規模化生產。

在接下來的研究中，他們計劃在技術和應用層面同時推進。首次，將嘗試整合其他類型的脫氨酶，來進一步豐富突變數據庫的多樣性。其次，還將探索這套系統在其他宿主細胞中的兼容性和適用性。在應用層面，研究團隊打算利用該系統來加速生物制造中關鍵酶的優化，以及推動其他重要生物分子的生產。通過優化這些關鍵酶，助力生物綠色生物經濟的發展進程。

參考資料：

1.Shao, M., Zhang, Z., Jin, X. et al. An orthogonal transcription mutation system generating all transition mutations for accelerated protein evolution in vivo.Nature Communications16, 6041 (2025). https://doi.org/10.1038/s41467-025-61354-4

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