摘要：流感疫苗的有效性和質(zhì)量控制依賴于對(duì)其關(guān)鍵抗原成分的精準(zhǔn)檢測(cè)，其中血凝素（HA）和神經(jīng)氨酸酶（NA）是兩種核心抗原。HA 是目前評(píng)估疫苗效力的主要指標(biāo)，而 NA 在病毒傳播和免疫保護(hù)中也發(fā)揮著重要作用。隨著疫苗技術(shù)的發(fā)展，對(duì) HA 和 NA 檢測(cè)方法的靈敏度、準(zhǔn)確性和適用性提出了更高要求。本文綜述了近年來(lái)流感疫苗中 HA 和 NA 主要檢測(cè)方法的研究進(jìn)展，包括傳統(tǒng)方法和新型技術(shù)的應(yīng)用與優(yōu)化。

一、血凝素（HA）檢測(cè)方法

HA 作為流感疫苗中誘導(dǎo)保護(hù)性免疫的關(guān)鍵抗原，其含量檢測(cè)是疫苗質(zhì)量控制的核心環(huán)節(jié)。目前已建立多種檢測(cè)方法，各有其優(yōu)勢(shì)與局限性。

1. 單向免疫擴(kuò)散法（SRID）

SRID 是目前檢測(cè) HA 含量的 “金標(biāo)準(zhǔn)”，自 1977 年被 FDA、WHO 等機(jī)構(gòu)推薦以來(lái)，廣泛應(yīng)用于流感疫苗的常規(guī)檢測(cè)。其原理是基于抗原與抗體在瓊脂糖凝膠中擴(kuò)散形成沉淀環(huán)，通過(guò)沉淀環(huán)直徑與抗原濃度的線性關(guān)系計(jì)算 HA 含量。

• 優(yōu)勢(shì)：特異性高，能反映具有免疫原性的 HA 三聚體含量，與疫苗的免疫效力直接相關(guān)。

• 局限性：操作繁瑣、耗時(shí)（需 18 - 24 小時(shí)），依賴特定參考品（制備周期長(zhǎng)達(dá) 2 - 3 個(gè)月），在大流行流感初期可能因參考品缺失而受限；此外，靈敏度較低（檢測(cè)限約 5 μg/mL），難以滿足低劑量或新型佐劑疫苗的檢測(cè)需求。

在四價(jià)流感疫苗（QIV）檢測(cè)中，傳統(tǒng) SRID 對(duì)兩種 B 型毒株（B/Yamagata 系和 B/Victoria 系）的交叉反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致誤差，因此采用雙價(jià)抗原參考品 SRID 法可提高檢測(cè)準(zhǔn)確性，其總體回收率達(dá) 97.8% - 107.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）<5%。

2. 高效液相色譜法（HPLC）

HPLC 基于 HA 的理化性質(zhì)實(shí)現(xiàn)分離定量，具有快速、靈敏、重復(fù)性好的特點(diǎn)，已成為 SRID 的重要替代方法。

• 反相高效液相色譜（RP - HPLC）：通過(guò)還原處理使 HA 裂解為 HA1 和 HA2 亞基，利用其疏水性差異分離，經(jīng)紫外或熒光檢測(cè)定量。該方法線性范圍寬（2.5 - 100 μg/mL），RSD <5%，適用于大流行期間參考品缺乏時(shí)的快速檢測(cè)，可區(qū)分不同 HA 亞型的分子差異，但無(wú)法反映 HA 的免疫原性。

• 體積排阻高效液相色譜（SE - HPLC）：無(wú)需裂解處理，直接保留 HA 的天然結(jié)構(gòu)和免疫原性，通過(guò)分子質(zhì)量差異分離。與 SRID 相關(guān)性良好，前處理簡(jiǎn)單，流動(dòng)相安全，適合生產(chǎn)過(guò)程中的快速質(zhì)控，但可能受相同分子質(zhì)量蛋白干擾，對(duì)疫苗純化工藝要求較高。

• 酶倍增免疫檢測(cè)技術(shù)（EMIT）：基于抗原抗體競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合原理，通過(guò)酶活性變化定量 HA，靈敏度達(dá) 10 nmol/L，但依賴特異性抗體，適用性受 HA 變異影響。

• 表面等離子體共振（SPR）：利用抗原抗體結(jié)合的動(dòng)力學(xué)變化檢測(cè)，靈敏度高（檢測(cè)限 <0.5 μg/mL），可同時(shí)檢測(cè)三價(jià)疫苗中的不同 HA 亞型，但設(shè)備成本較高。

NA 作為流感病毒的另一關(guān)鍵抗原，其含量和活性與疫苗免疫效果密切相關(guān)，但檢測(cè)方法的標(biāo)準(zhǔn)化仍有待完善。

1. 雙抗體夾心 ELISA 法

通過(guò)制備 NA 保守序列的通用抗體，以鼠源抗體為包被抗體、HRP 標(biāo)記的兔源抗體為檢測(cè)抗體，建立定量檢測(cè)方法。該方法線性范圍寬（20 - 640 ng/mL，R2>0.99），準(zhǔn)確度高（回收率 85.41% - 103.81%），重復(fù)性好（CV <10%），可用于流感疫苗生產(chǎn)過(guò)程中的 NA 質(zhì)量控制。與熒光底物法檢測(cè)的 NA 活性呈正相關(guān)（R2=0.9792），但僅適用于單價(jià)疫苗檢測(cè)，對(duì)多價(jià)疫苗的亞型區(qū)分能力有限。

2. 熒光底物法

以 4 - MUNANA 為底物，通過(guò)檢測(cè) NA 催化產(chǎn)生的熒光產(chǎn)物強(qiáng)度定量其活性。該方法操作簡(jiǎn)便，可反映 NA 的酶功能，但易受病毒結(jié)構(gòu)破壞影響，無(wú)法區(qū)分活性喪失但仍具免疫原性的 NA。

3. 其他方法

• 同位素稀釋質(zhì)譜法（IDMS）：可同時(shí)定量多價(jià)疫苗中不同亞型的 NA，精度高，但步驟繁瑣，無(wú)法評(píng)估 NA 的完整性。

• VaxArray 試劑盒：基于多重夾心免疫檢測(cè)，特異性和靈敏度高（定量范圍 1 - 60 ng/mL），適用于低 NA 含量或含佐劑疫苗的檢測(cè)，但成本較高。

HA 和 NA 的檢測(cè)方法各有側(cè)重：SRID 和 SE - HPLC 適用于評(píng)估具有免疫原性的抗原含量，HPLC 系列方法適合快速定量和工藝優(yōu)化，ELISA 和熒光法在 NA 檢測(cè)中表現(xiàn)出良好的實(shí)用性。未來(lái)研究需進(jìn)一步提升方法的通用性（如應(yīng)對(duì)病毒變異）、靈敏度（如低劑量疫苗）和自動(dòng)化程度，推動(dòng)多方法聯(lián)合應(yīng)用以全面評(píng)估疫苗質(zhì)量。同時(shí)，NA 檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)化和參考品體系的完善將是提升流感疫苗質(zhì)量控制的重要方向。

流感疫苗的有效性是質(zhì)量控制的最重要指標(biāo)之一，通過(guò)對(duì)其關(guān)鍵抗原成分的精準(zhǔn)檢測(cè)實(shí)現(xiàn)對(duì)有效性的良好控制，其中血凝素（HA）和神經(jīng)氨酸酶（NA）是兩種核心抗原。HA 是目前評(píng)估疫苗效力的主要指標(biāo)，而 NA免疫保護(hù)中也發(fā)揮著一定程度的作用。

當(dāng)前國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上銷售的以雞胚為基質(zhì)的流感裂解疫苗存在兩種不同工藝，其放行標(biāo)準(zhǔn)均參考《中國(guó)藥典》（2020 年版三部）。這兩種工藝生產(chǎn)的疫苗，在血凝素（HA）和神經(jīng)氨酸酶（NA）純度和含量分布上存在哪些本質(zhì)差異？有關(guān)雜質(zhì)殘留的放行標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)否一致？歡迎大家在評(píng)論區(qū)留言交流！

參考文獻(xiàn)：

[1] 鄧濤，呂傳碩，劉京，等。流感疫苗神經(jīng)氨酸酶含量雙抗體夾心 ELISA 定量檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用 [J]. 中國(guó)生物制品學(xué)雜志，2022, 35 (4): 440 - 447.
[2] 劉朝陽(yáng)，孟佳帆，程鵬飛。流感疫苗血凝素含量檢測(cè)方法的研究進(jìn)展 [J]. 中國(guó)生物制品學(xué)雜志，2013, 26 (4): 574 - 577.
[3] 劉朝陽(yáng)，周欣，王石磊，等。四價(jià)流感病毒裂解疫苗血凝素含量檢測(cè)方法的驗(yàn)證 [J]. 中國(guó)生物制品學(xué)雜志，2016, 29 (1): 61 - 65.
[4] 童光偉，吳業(yè)紅。高效液相色譜在流感疫苗血凝素含量檢測(cè)中的應(yīng)用進(jìn)展 [J]. 中國(guó)生物制品學(xué)雜志，2023, 36 (8): 1005 - 1009.
[5] 李肖雅，吳金妍。流感病毒神經(jīng)氨酸酶及其抑制抗體檢測(cè)方法的研究進(jìn)展 [J]. 國(guó)際生物制品學(xué)雜志，2021, 44 (3): 175 - 180.

識(shí)別微信二維碼，添加生物制品圈小編，符合條件者即可加入

生物制品微信群！

請(qǐng)注明：姓名+研究方向！

本公眾號(hào)所有轉(zhuǎn)載文章系出于傳遞更多信息之目的，且明確注明來(lái)源和作者，不希望被轉(zhuǎn)載的媒體或個(gè)人可與我們聯(lián)系(cbplib@163.com)，我們將立即進(jìn)行刪除處理。所有文章僅代表作者觀不本站。