2 025 年 5 月 23 日，香港中文大學 ( 深圳 )GoranStjepanovic團隊與南方科技大學醫學院生化系蘇明媛課題組在

Science Advances

Mechanism of D-type cyclins recognition by the AMBRA1 E3 ligase receptor

AMBRA1 是一種腫瘤抑制因子，通過 作為 泛素 連接酶 的底物受體調控 D 型細胞周期蛋白的穩定性與細胞增殖。本研究解析了分辨率為 3.55 ? 的 D 型細胞周期蛋白 cyclin D1 與 AMBRA1-DDB1 復合物的冷凍電鏡結構，揭示 AMBRA1 WD40 結構域特異性識別 cyclin D1 C 末端磷酸化區域（ Thr286 ）。該機制依賴磷酸化信號形成的獨特構象，并促進其與 AMBRA1 的結合。此外， AMBRA1 結合缺陷突變體會導致 cyclin D1 積累和 DNA 損傷。本研究加深了對細胞周期調控的理解，并為相關癌癥治療提供新思路 。

為了闡明 AMBRA1 的底物識別機制，研究者 共表達 cyclin D1-CDK4 與 AMBRA1 WD40 -DDB1 復合物，并利用冷凍電鏡解析了分辨率為 3.55 ? 的 DDB1-AMBRA1 WD40 -cyclin D1-CDK4 結構。分析顯示， cyclin D1 的 C 末端磷酸化降解信號基序（轉角和 3 10 螺旋）與 AMBRA1 WD40 底物結合界面相互作用，促進 E3 泛素連接酶對底物的泛素化，調控 D 型細胞周期蛋白的降解與細胞周期進程。此外， AMBRA1 WD40 結構域通過獨特特征特異性識別 cyclin D1 的 C 末端磷酸化信號，依賴疏水作用、氫鍵和靜電相互作用。具體而言， pThr286 與 AMBRA1 WD40 的 R96 、 H75 側鏈及 T97 主鏈 NH 形成氫鍵，疏水殘基（ V290 ， V293 ， I295 ）與 WD40 的疏水口袋（ F57 、 W99 ）相互作用穩定結合，靜電表面勢則促進 I295 羧基結合。突變分析表明，關鍵殘基 （ F57 、 H75 、 R96 、 W99 ）的突變可完全破壞 AMBRA1 與 cyclin D1 的互作，證明 pThr286 結合位點和疏水口袋對兩者結合至關重要 。

圖1. DDB1-AMBRA1WD40-cyclinD1-CDK4蛋白復合物純化及結構解析

研究者接著探討了細胞周期蛋白 cyclin D1 與 AMBRA1 相互作用對 U2OS 細胞 DNA 損傷的影響。前期研究發現， AMBRA1 缺失會顯著增加細胞增殖、 S 期富集和復制壓力導致 DNA 損傷，而 CHK1 抑制劑 AZD7762 處理細胞會進一步加劇這些效應。在 U2OS 細胞中，研究者通過 siRNA 敲低 AMBRA1 ，發現 cyclin D1 表達水平升高，并且在 AZD7762 處理的細胞中 DNA 損傷顯著增加。在回補實驗中，野生型 AMBRA1 的表達能降低 cyclin D1 的表達水平并恢復細胞表型，而 AMBRA1 的 cyclin D 1 關鍵結合位點（ F57 、 W99 、 H75 和 R96 ）突變則無法降低 cyclin D1 的表達，也不能恢復細胞的內源性 DNA 損傷。

圖2. AMBRA1 的cyclinD1結合突變體導致DNA損傷

綜上所述， AMBRA1 WD40 結構域以磷酸化依賴的方式與 D 型細胞周期蛋白互作并介導其泛素化降解，從而調控 D 型細胞周期蛋白水平，在防止復制壓力和維持基因組穩定性中發揮至關重要的作用。這些發現強調了 AMBRA1 在細胞周期調控和維持基因組穩定性中的核心地位，并為理解其在癌癥發生中的潛在機制提供了重要見解。

D 型細胞周期蛋白（ Cyclin D1 、 D2 、 D3 ）的過表達常與癌癥發生相關。 AMBRA1 通過與 CRL4 E3 連接酶的互作調控 D 型細胞周期蛋白的穩定性，防止其過度積累導致惡性細胞增殖。本研究解析了 DDB1-AMBRA1 WD40 -cyclinD1-CDK4 復合物的結構，揭示 AMBRA1 WD40 結構域是識別 D 型細胞周期蛋白的關鍵元件，其與 DDB1 的互作對泛素化降解 cyclin D1 至關重要。 AMBRA1 通過磷酸化依賴的方式識別 cyclin D1 的 C 末端，該機制對 D 型細胞周期蛋白具有普適性。 CRL4 AMBRA1 復合物在靶向 D 型細胞周期蛋白進行泛素化和降解過程中發揮關鍵作用，其活性對細胞周期控制至關重要。在癌癥治療中，靶向 DDB1-AMBRA1-cyclin D1 復合物可增強 cyclin D1 的降解，提高 CDK4/6 抑制劑療效，克服耐藥性并改善治療效果。本研究為理解AMBRA1在細胞周期調控中的作用提供了新見解，并為開發針對E3連接酶復合物的小分子藥物提供了結構基礎，為治療細胞周期蛋白失調相關疾病提供了潛在方法。

香港中文大學（深圳）醫學院科比爾卡創新藥物研究院助理教授 Goran Stjepanovic 和南方科技大學醫學院生化系蘇明媛副教授為該論文的共同通訊作者。香港中文大學（深圳）博士后王洋和博士生劉明為該論文的共同第一作者 。

蘇明媛課題組長期致力于用結構生物學、分子生物學和生物化學方法深入探究蛋白質穩態調控的分子機制，特別關注在自噬、溶酶體通路 和泛素蛋白酶 體降解系統中相關蛋白復合物的作用機制。現因發展需要，公開招聘具有細胞生物學或結構生物學背景的博士后。歡迎有意向的人士咨詢。

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