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神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞是大腦中主要的細胞類型，它們之間存在廣泛的相互作用，但其相互作用的分子基礎在很大程度上仍不清楚。

基于此，2025年6月11日，美國加利福尼亞大學Baljit S. Khakh研究團隊在Neuron雜志發(fā)表了“The cell-surface shared proteome of astrocytes and neurons and the molecular foundations of their multicellular interactions”揭示了星形膠質(zhì)細胞與神經(jīng)元的細胞表面共有蛋白質(zhì)組及其多細胞相互作用的分子基礎。

作者鑒定并繪制了紋狀體中星形膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元的細胞表面蛋白（CSPs）圖譜，發(fā)現(xiàn)其中許多蛋白是兩者共有的，構(gòu)成了連接紋狀體星形膠質(zhì)細胞與神經(jīng)元相互作用位點的星形膠質(zhì)細胞-神經(jīng)元細胞表面共有蛋白質(zhì)組（CS SPAN）。CS SPAN 中富含細胞外基質(zhì)蛋白、細胞粘附分子、轉(zhuǎn)運體、離子通道和G蛋白偶聯(lián)受體等成分。通過追蹤星形膠質(zhì)細胞CSPs的細胞來源，識別出星形膠質(zhì)細胞與多種實質(zhì)細胞之間的相互作用。這些發(fā)現(xiàn)總體上與人類數(shù)據(jù)一致。在亨廷頓病（HD）小鼠模型中，病理生理變化及其由基因干預引起的緩解分別伴隨著CS SPAN和CSPs的異常改變與恢復。CS SPAN中還包含在多種腦部疾病中失調(diào)的分子。本研究從分子層面揭示了星形膠質(zhì)細胞與神經(jīng)元之間的界面結(jié)構(gòu)，為探索其生理功能及其在腦疾病中的作用提供了機制性基礎。

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圖一 用于蛋白質(zhì)生物素標記的星形膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元細胞表面HRP

本研究的目標是系統(tǒng)記錄星形膠質(zhì)細胞與神經(jīng)元之間的細胞表面共有蛋白質(zhì)組。為了鑒定細胞表面蛋白（CSPs），作者采用了基于鄰近依賴的生物素標記技術(shù)，并利用在成年小鼠紋狀體中體內(nèi)表達的、由腺相關(guān)病毒（AAV）攜帶的細胞表面定位的辣根過氧化物酶（HRP）實現(xiàn)對特定細胞類型的標記。還比較了另一種常用的標記工具TurboID，但在HEK293細胞中測試后，選擇了HRP進行細胞表面標記，因為它不需要額外添加ATP，且對細胞內(nèi)蛋白的標記較少。用于HRP的生物素探針（BxxP）無法穿過細胞膜，因此更有利于標記細胞表面蛋白。作者構(gòu)建了可在星形膠質(zhì)細胞或神經(jīng)元中表達細胞表面HRP的AAV病毒載體，并進行了驗證、細胞表面蛋白的鑒定、定位分析，以及在亨廷頓病模型中這些蛋白及其動態(tài)變化的評估。紋狀體參與多種疾病的發(fā)生，包括亨廷頓病，同時也是星形膠質(zhì)細胞與神經(jīng)元之間廣泛接觸的腦區(qū)。其中約95%的神經(jīng)元是DARPP32陽性的中等棘神經(jīng)元（MSNs）。在H?O?和不能透過細胞膜的BxxP存在的情況下，HRP可以生成反應性自由基，從而將附近的蛋白質(zhì)標記上生物素。通過免疫組織化學染色和Western blot檢測了生物素標記的效果。S100β和Sox9是星形膠質(zhì)細胞的標志物，而NeuN和DARPP32則用于識別中等棘神經(jīng)元。靶向星形膠質(zhì)細胞的HRP（AstroHRP）主要表達于約90%的紋狀體星形膠質(zhì)細胞中，而在神經(jīng)元中幾乎不表達。靶向神經(jīng)元的HRP（NeuroHRP）則在約95%的中等棘神經(jīng)元中表達，未見于星形膠質(zhì)細胞。HRP及其介導的生物素標記僅出現(xiàn)在大腦注射側(cè)；蛋白標記依賴于HRP的表達以及0.03%H?O?的存在；標記的蛋白可以通過鏈霉親和素磁珠富集。在表達細胞表面HRP的腦片中觀察到了H?O?介導的生物素標記，但在將H?O?加入表達HRP的腦片裂解液中時并未出現(xiàn)標記信號，這表明不存在非特異性標記。

圖二 紋狀體星形膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元的CSP譜型分析

在向紋狀體星形膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元中特異性表達細胞表面HRP的AAV注射約4周后，作者分離了紋狀體組織，進行免疫組化檢測并富集生物素標記的蛋白用于液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）分析。共使用三批小鼠，分別接受Astro HRP或Neuro HRP處理，并完成CSP標記與鑒定。通過比較HRP樣本與對照樣本中蛋白的標簽自由定量（LFQ）強度值，并以倍數(shù)變化（FC）進行篩選，分別鑒定出688個星形膠質(zhì)細胞CSPs和584個神經(jīng)元CSPs。GO分析顯示，這些蛋白主要定位于細胞膜、細胞外圍、膜固有成分、細胞連接和突觸，說明HRP有效地標記了細胞表面和胞外蛋白。將Astro HRP和Neuro HRP鑒定到的CSPs與此前利用Lck-BioID2技術(shù)標記細胞膜內(nèi)側(cè)的蛋白進行了比較。結(jié)果顯示，Astro HRP主要檢測到來自細胞表面和胞外空間的蛋白，而Astro Lck-BioID2則更多檢測到膜內(nèi)或鄰近區(qū)域的蛋白，Neuro HRP與Neuro Lck-BioID2之間的比較也呈現(xiàn)類似趨勢。這進一步驗證了Astro HRP和Neuro HRP能夠有效標記細胞表面及胞外蛋白，有助于揭示星形膠質(zhì)細胞與神經(jīng)元之間的相互作用。在鑒定出的688個星形膠質(zhì)細胞CSPs和584個神經(jīng)元CSPs中，有561個是兩者共有的?？紤]到星形膠質(zhì)細胞與神經(jīng)元之間緊密接觸的特性，這種高度重疊可能表明Astro HRP不僅標記了星形膠質(zhì)細胞表面蛋白，也標記了鄰近神經(jīng)元的蛋白，反之亦然。為了驗證這種重疊是否反映細胞間相互作用而非非特異性標記，將HRP靶向至內(nèi)皮細胞表面并鑒定其CSPs，結(jié)果顯示僅有極少數(shù)與星形膠質(zhì)細胞或神經(jīng)元CSPs重疊，支持了標記方法的特異性。結(jié)果顯示，約三分之二的共有蛋白來源于星形膠質(zhì)細胞或神經(jīng)元，其余為非富集蛋白。在CS SPAN中，檢測到了多個已知的星形膠質(zhì)細胞蛋白如Slc1a2和Bcan，以及神經(jīng)元蛋白如Gpm6a和Slc17a7。此外，還發(fā)現(xiàn)了參與細胞粘附的GPCRs、神經(jīng)連接蛋白、突觸形成和清除相關(guān)蛋白，以及多種細胞外基質(zhì)蛋白和粘附分子。來自少突膠質(zhì)細胞的髓鞘蛋白Plp1也被檢測到，這與紋狀體中豐富的有髓纖維及其與星形膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元的密切接觸一致。在獨有CSPs中，識別出了典型的星形膠質(zhì)細胞蛋白如Dag1和S1pr1，以及神經(jīng)元蛋白如Kcnh5。此外，突觸蛋白Vamp2也在星形膠質(zhì)細胞中被檢測到，盡管其mRNA主要在神經(jīng)元中表達，這可能反映了星形膠質(zhì)細胞對突觸的高度包裹狀態(tài)或其蛋白水平與轉(zhuǎn)錄水平的不一致?？偟膩碚f，鑒定出大量星形膠質(zhì)細胞與神經(jīng)元共有的細胞表面蛋白，構(gòu)建了CS SPAN圖譜，揭示了這兩類細胞在分子層面的直接互作網(wǎng)絡。

圖三 星形膠質(zhì)細胞與神經(jīng)元的CSPs及其與亨廷頓病、多細胞相互作用及中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的關(guān)系

在亨廷頓病相關(guān)數(shù)據(jù)分析中，作者將從星形膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元中分別鑒定出的58個和142個細胞表面差異表達蛋白（CS DEPs）與近期發(fā)表的人類單核RNA測序的HD數(shù)據(jù)進行了比較。在從星形膠質(zhì)細胞中檢測到的58個CS DEPs中，有21個（36%）在snRNA-seq數(shù)據(jù)中也表現(xiàn)出類似的改變，并主要映射到星形膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元；其中19個在N-ZFP干預后得到恢復。而在從神經(jīng)元中檢測到的142個CS DEPs中，有78個（55%）在snRNA-seq數(shù)據(jù)中一致下調(diào)，主要映射到神經(jīng)元，并且大多數(shù)也能通過N-ZFP恢復。綜上所述，對HD模型小鼠中星形膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元的CSPs分析揭示了顯著的疾病相關(guān)變化，這些變化可以被定位、被N-ZFP逆轉(zhuǎn)，并得到了驗證。作者揭示了在星形膠質(zhì)細胞與神經(jīng)元與其他實質(zhì)細胞相互作用位點中排名前兩位的兩種CSP蛋白。此外，作者評估了CSSPAN以及CSPs與已知人類基底節(jié)疾病相關(guān)基因之間的重疊情況。結(jié)果顯示，在多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，由疾病相關(guān)基因編碼的蛋白質(zhì)大多屬于CSPs，尤其是來自CS SPAN。數(shù)據(jù)顯示，約20%具有已知人類疾病關(guān)聯(lián)的CSPs屬于CS SPAN。還進一步分析了CS SPAN與精神分裂癥和衰老腦組織中鑒定出的“突觸神經(jīng)元與星形膠質(zhì)細胞程序”（SNAP）基因之間的重疊，以及與帕金森?。≒D）死后snRNA-seq數(shù)據(jù)中改變的神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞基因的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，多個核心的SNAP和PD相關(guān)基因也存在于CS SPAN中。最后，CS SPAN中還包括了一些已被鑒定為在小鼠學習相關(guān)星形膠質(zhì)細胞（LAAs）中表達的基因。作者的研究結(jié)果表明，CS SPAN介導了與化學突觸傳遞、細胞粘附、神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運以及突觸組裝調(diào)控相關(guān)的蛋白質(zhì)機制和通路，可能在人類疾病和大腦可塑性中發(fā)揮重要作用。

總結(jié)

作者發(fā)現(xiàn)，從星形膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元中檢測到的CSPs不僅包括多個已知功能的蛋白質(zhì)，也包含許多功能尚未明確的蛋白。這一發(fā)現(xiàn)與以往對星形膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元進行蛋白質(zhì)組研究的結(jié)果一致，說明蛋白表達與基因表達之間并非簡單的線性關(guān)系。尤其對于膜蛋白而言，這意味著僅依賴RNA測序可能遺漏了一些重要的信號傳導介質(zhì)。從這一角度出發(fā)，蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)鑒定出在CS SPAN中星形膠質(zhì)細胞與神經(jīng)元細胞表面共享的蛋白，揭示了這些蛋白所參與的主要功能類別，包括細胞外基質(zhì)、化學突觸傳遞、細胞粘附、神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運以及突觸組裝的調(diào)控。綜上所述，這些鑒定出的蛋白應被進一步研究以探索與星形膠質(zhì)細胞-神經(jīng)元相互作用相關(guān)的蛋白質(zhì)機制的分子基礎及其功能意義。

文章來源

https://doi.org/10.1016/j.neuron.2025.05.019