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神經元胞質鈣離子濃度變化是其興奮性和反應性的重要指標。細胞內鈣瞬變反映神經元對內外刺激產生的興奮性反應的大小。GCaMP在神經科學中的應用，使得實時動態可視地監測特異或非特異神經元群的活動成為現實。

采用24只成年Pirt-GCaMP6s小鼠，體質量25~30g，8~12周齡，雌雄各半，進行DRG神經元的鈣成像研究。小鼠飼養環境按照標準的12h光照/12h黑暗循環，自由攝食、飲水。所有行為學實驗均在9:00至13:00的光照期內進行，檢測人員對動物分組不知情。小鼠于行為學實驗前3d和1d在行為學實驗室適應兩次，并在每次實驗前適應30min。

TNBS誘導結腸炎模型

隨機選取4只BALB/c、8只C57BL/6J和12只Pirt-GCaMP6s小鼠作為結腸炎組，其余小鼠作為對照組。結腸炎組小鼠用2%的異氟烷氣體麻醉，凡士林潤滑肛門周圍并保護皮膚不與灌腸藥物接觸。5%TNBS在50%的乙醇溶液中稀釋至2.5%。以每只小鼠100μL的劑量通過注射器連接聚乙烯導管經肛門直腸給藥，給藥深度15~20mm。為避免藥物外溢，仰臥位45°角抬高鼠尾，1min后放回飼養籠，連續7d。對照組采用等劑量0.9%氯化鈉溶液灌腸。以小鼠糞便性狀發生改變，糞便呈稀糊狀且為血便為造模成功標準。

觀察指標與檢驗方法

皮膚EB外滲實驗：造模7d后，對BALB/c小鼠尾靜脈注射EB染料（1%）100μL。EB注射后30min，經心臟灌流0.1mol/L的PBS。剃毛后觀察皮膚的藍色滲出位置并拍照，使用Image J軟件測量其皮膚上藍色滲出面積，量化神經源性炎性反應的面積。

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小鼠行為學實驗：

造模7d后，檢測C57BL/6J小鼠對下背部、雙側足底機械痛刺激的行為反應，計算回避或縮足次數，評估小鼠對機械刺激的敏感性。剃除C57BL/6J小鼠下背部的毛，露出皮膚，置于單獨的塑料箱中，并在實驗前適應30min。然后實驗人員用Von Frey細絲垂直刺激測試區域皮膚至纖維絲彎曲，下背部的刺激量為0.04g，后爪為0.4g，每次接觸1s，重復10次為1組。在下背部測試中，如果小鼠（1）突然前行或轉身（2）跳躍（3）立即舔、抓或擦拭刺激部位，則計為陽性回避反應。在后爪部測試中，若小鼠快速垂直或水平移動后爪遠離刺激，則計為陽性縮足反應。如果誘發了陽性反應，則需在小鼠復位后再施加下一個刺激。陽性反應以回避或縮足次數表示，每只小鼠重復測試3組，每組間隔5min，計算平均值。

DRG神經元反應性：造模7d后，每組取6只Pirt-GCaMP6s小鼠給予60 mm Hg（1mmHg≈0.133kPa）壓力的直結腸擴張（colorectal disten?tion, CRD）刺激和下背部皮膚毛刷刺激，觀察L6DRG神經元鈣活動的變化；另每組取6只給予后爪皮膚機械（毛刷、200g鉗夾）刺激，觀察L4DRG神經元的變化。給予上述刺激之前，Pirt-GCaMP6s小鼠用2%的異氟烷麻醉，氣管插管。行部分椎板去除術暴露右側L6或L4DRG，剝離鞘膜，清理出血。小鼠俯臥位固定在定制的顯微鏡臺上，脊髓夾固定所記錄節段DRG上或下一節的錐體上關節突，固定臺可以上下及軸向調節，使小鼠被檢測的DRG充分暴露在物鏡下，成像全過程避免任何位移。實驗全程通過氣管插管進行呼吸麻醉監控，鼠尾套管式紅外傳感器無創監測心率和血氧飽和度。將小鼠置于10×/0.3的長工作距離的共聚焦熒光顯微鏡空氣物鏡下成像。以14s/幀速度1024×1024像素分辨率對完整的L6或L4DRG進行z軸延時疊加，并根據DRG大小和角度調整。成像過程全程用反饋式保溫和加熱墊使小鼠體溫保持在36.0~37.0℃。激光波長為488nm，激光強度為5%，掃描速度為400~600Hz。神經元被激活可引起GCaMP與細胞內Ca2+結合，發出綠色熒光。神經元激活引起熒光強度變化以刺激誘發的最大亮度與基礎亮度的比值（Ft/F0）表示。神經元激活的定義為熒光強度的增加≥基線30%。通過比較CRD刺激、體表毛刷刺激或壓力刺激所激活的神經元數量占總數的百分比和熒光強度的變化來判斷軀體神經元敏化。小型、中型和大型神經元胞體直徑分別為<20μm、20~30μm、>30μm。

通過Pirt-GCaMP6s小鼠在體觀察DRG中神經元群鈣離子熒光的瞬時變化，量化內臟痛誘發的神經元活動變化。分別給予對照組和結腸炎組小鼠CRD 60 mm Hg刺激，記錄刺激前后L6DRG神經元的變化。

結腸炎小鼠體表EB滲出點和機械痛閾值的變化

TNBS模型小鼠對下背部和后爪的機械刺激表現出更容易誘發回避或縮足行為，說明這些部位皮膚存在感覺過敏。而下背部皮膚和后爪分別由L6和L4DRG支配。

參考文獻：

• Investigation of Pain Mechanisms by Calcium Imaging Approaches[J]. Michael Anderson;Qin Zheng;Xinzhong Dong.Neuroscience Bulletin,2018(01)

• 高昕妍,張楠,劉坤,等.結腸炎模型小鼠內臟痛及穴位敏化的外周神經機制探討[J].針刺研究,2023,48(12):1183-1192.