靶抗原的選擇是ADC藥物開發成功的主要因素。靶點是 ADC藥物主要識別腫瘤細胞和被內吞的主要媒介，影響藥物的成藥性和競爭格局。下表為大家總結了目前已經上市的19款ADC的靶點信息，靶點分別為CD33、CD30、HER2、CD22、CD79b、Nectin-4、BCMA、EGFR、CD19、Tissue Factor、FRα和cMET。據統計在研的425款ADC藥物中較為熱門的靶點包括HER2、EGFR、CLDN18.2、TROP2、c-Met、CD19、PSMA、Muc1、BCMA和PDL1，大多數為驗證成熟的靶點。

已上市ADC信息匯總表

今天為大家解讀一篇關于篩選ADC合適靶點的文章，一起學習起來。

在開發新型抗體偶聯藥物（ADC）療法時，可采用適應癥依賴型或適應癥獨立型策略來篩選合適靶點。適應癥依賴型策略顧名思義，是通過聚焦特定疾病類型展開研究，進而選定針對該疾病的靶點及相應ADC。另一種適應癥獨立型靶點篩選方式，則是根據內化作用等功能特征而非特定疾病類型來識別靶點，隨后再基于該靶點的表達情況選擇匹配適應癥。這兩種策略并非互斥，且均需遵循合適ADC靶點的關鍵特征要求。本文將詳細探討這些特征以及兩種ADC靶點篩選策略，同時還將闡述涉及雙特異性ADC或聯合療法的靶向策略。

2.1 最佳ADC靶點的特性

ADC通過將強效細胞毒素與識別腫瘤相關抗原的抗體結合，實現細胞毒藥物的腫瘤靶向遞送，從而規避傳統化療藥物引發的全身毒性。特定ADC療效最大化與毒性最小化的關鍵始于靶點的精準篩選。理想ADC靶點應具備以下特征：1）僅存于腫瘤組織而在正常組織中不表達；2）在腫瘤內呈高密度均勻分布；3）與ADC結合后能快速內化；4）并完全定位于溶酶體以實現細胞毒素彈頭的高效釋放（表2.1）。

表2.1 ADC最佳靶點的特征：理想與現實

然而完全符合所有標準的靶點可能并不存在，因此實際開發中只需滿足部分條件的靶點即可視為優選。優質靶點應滿足：1）相較于正常組織在腫瘤中過表達（即腫瘤相關而非腫瘤特異）；2）在腫瘤中表達密度足以介導ADC產生使腫瘤消退或至少停滯的細胞毒性；3）與ADC結合后能高效內化并轉運至溶酶體，且極少再循環至細胞表面，從而促進彈頭的后續加工與釋放（圖2.1）。

圖2.1 ADC靶標的內化與溶酶體定位。將GFP轉染細胞用針對ADC靶標的抗體處理4小時，該抗體通過偶聯的pH傳感器染料實現標記——當定位到溶酶體時會發出熒光。隨后使用Cellomics成像儀對細胞進行分析，捕捉并量化內化及溶酶體定位事件（a和b）。如(a)所示，可清晰觀察到抗體在細胞內的點狀染色。圖(b)展示了靶標抗體被內化的細胞高倍放大圖像。通過共聚焦顯微鏡進一步驗證抗體內化與溶酶體定位：將熒光標記抗體與細胞共孵育指定時間后，使用抗LAMP-1抗體進行溶酶體定位檢測（c和d）。如(c)所示，0小時時間點可見抗體在細胞表面結合，但經過一小時后，明亮的共定位信號清晰表明抗體已進入溶酶體。

現有假說認為，降低ADC毒性的關鍵在于使靶標在正常組織中的表達量最小化。但關于靶標"純凈度"需達到何種程度才能確保ADC安全有效，目前學界仍存爭議。臨床ADC靶標的mRNA表達譜顯示，許多靶標在多種正常組織中存在低至中度表達。針對細胞表面靶標開發療法時，僅關注mRNA表達譜存在局限性：雖然mRNA轉錄水平與蛋白表達存在相關性，但轉錄后調控機制可能削弱這種關聯；此外，翻譯后修飾或細胞定位改變也會降低靶標在細胞表面的豐度。因此，靶標蛋白表達及細胞定位分析通常比單純依賴mRNA數據更具參考價值。蛋白質組學分析表明，血液系統惡性腫瘤和實體瘤的臨床ADC靶標中，多數在廣泛正常組織中呈現中度蛋白表達。典型案例如HER2在正常組織的表達——盡管該靶標在多種正常組織中水平較低，但曲妥珠單抗及其偶聯藥物Kadcyla?（由曲妥珠單抗與細胞毒素DM1偶聯而成）仍表現出可接受的毒性，并成功獲批用于治療HER2過表達乳腺癌。值得注意的是，曲妥珠單抗偶聯藥物引發心肌病的發生率似乎低于曲妥珠單抗聯合蒽環類藥物的方案。另一案例是靶向NaPi2b的抗體偶聯藥物lifastuzumab vedotin（攜帶微管抑制劑MMAE），目前正針對卵巢癌和非小細胞肺癌開展臨床試驗。雖然NaPi2b在這兩種適應癥中過表達，但其在肺組織的表達曾引發安全性擔憂。然而最新臨床數據顯示，該藥物未出現肺部不良事件或劑量限制性毒性。這些案例表明，抗原在正常組織的表達未必導致不可接受的毒性。表達靶標器官未出現毒性或毒性輕微的現象提示：判斷ADC耐受性時，需綜合評估其整體構成和行為特征，而非僅關注抗原表達。諸如內化速率或彈頭作用機制等特性，均可能影響藥物的療效與安全性。

目前雖未建立ADC理想內化速率與活性之間的明確關聯范式，但大量數據支持更快速的內化可能帶來更佳療效的觀點。理論上，快速內化能加速偶聯細胞毒素彈頭的遞送，從而增強細胞毒性效應。然而研究顯示，作為曲妥珠單抗-美坦新偶聯藥物（T-DM1）抗體組分的曲妥珠單抗，其內化速率相較于其他已知ADC更為緩慢——但該藥物仍展現出顯著療效。這種相對緩慢的內化特性可能解釋了為何T-DM1對細胞表面HER2低表達的細胞和腫瘤療效較弱。因此，在內化速率較慢的情況下，需要更高水平的細胞表面HER2表達才能結合并內化足夠數量的ADC，從而實現有效的細胞殺傷。這也可能是T-DM1引發心臟毒性的因素之一，因為心肌細胞的HER2表達量顯著低于HER2過表達腫瘤。

若已知某ADC靶標在正常組織中存在表達，則必須評估該組織中彈頭毒素的潛在毒性。針對同一抗原但搭載不同彈頭的ADC可能呈現顯著差異的毒性特征。例如，靶向癌胚抗原5T4的ADC藥物PF-06263507（搭載auristatin類彈頭MMAF）在食蟹猴中劑量高達10mg/kg時仍表現良好耐受性，未出現明顯毒性；而早期搭載DNA靶向彈頭卡奇霉素的抗5T4 ADC，在相似有效劑量下卻無法被食蟹猴耐受。值得注意的是，針對其他靶點的卡奇霉素ADC（這些靶標具有不同的正常組織表達譜）在5T4靶向ADC出現毒性的劑量下仍表現安全，這表明毒性是靶標介導的，而非卡奇霉素偶聯物的普遍脫靶效應。

以曲妥珠單抗-美坦新偶聯藥（T-DM1）為例，其彈頭DM1的作用機制可能是該ADC在治療劑量下未引發顯著心肌細胞毒性的原因。成年人心肌細胞的增殖率極低，而微管蛋白抑制劑（如auristatin類和美坦新類）對高增殖率腫瘤細胞最為有效，對相對靜止的細胞作用較弱。因此，T-DM1所觀察到的輕微心肌毒性可能正是因為其彈頭對低增殖細胞的殺傷作用有限。

目前，多個研究團隊已報道基于曲妥珠單抗的ADC臨床前研究，這些ADC搭載了可能對低增殖細胞具有毒性的不同彈頭。未來值得關注這些ADC是否會引發額外毒性，尤其是心臟毒性發生率的潛在升高。

細胞表面抗原是否適合作為ADC靶點還取決于其他關鍵因素。如前所述，ADC/抗原復合物在細胞表面結合后的內化速率會影響藥物療效——但結合與內化僅是ADC釋放活性彈頭的第一步。后續關鍵在于：內化后的ADC/抗原復合物將經歷怎樣的命運？目前大多數在研ADC需要依賴溶酶體的蛋白水解作用來釋放活性細胞毒素：通過酶切可裂解連接子，或通過抗體蛋白降解釋放非可裂解連接子偶聯的彈頭。因此，ADC/抗原復合物必須被轉運至內體/溶酶體系統才能完成有效加工。

判斷某抗原是否適合作為ADC靶點，需明確其內化后的主要轉運路徑：是進入內體/溶酶體系統，還是通過其他途徑？某些抗原會常規性循環回細胞表面，而抗體本身也可能通過FcRn介導的循環途徑持續外排。雖然這種循環可延長抗體或ADC的半衰期，但若ADC/抗原復合物在溶酶體中的加工量不足，反而會削弱ADC活性或誘發耐藥。近期抗體工程技術已能引導抗體/抗原復合物走向蛋白水解途徑而非循環途徑，但這些研究多在未偶聯抗體中進行。目前尚不明確：經過pH依賴性結合改造或FcRn結合減弱的抗體是否適用于ADC。因此，必須明確靶標本身的主要導向路徑是蛋白水解途徑還是循環途徑。

對于已知在正常組織中表達的靶標，還需探究腫瘤與正常組織是否存在不同的加工途徑。例如，ADC/抗原復合物可能在癌細胞中被轉運至溶酶體，而在正常細胞中循環回細胞表面——盡管目前尚無文獻支持這一假說。這種潛在差異可能為提升ADC治療窗口提供新思路。

綜合這些因素，關鍵在于理解一種具有特定內化速率和特定彈頭的ADC，會如何影響表達低至中度水平靶標的正常組織。此外，闡明ADC/抗原復合物在細胞表面結合并內化進入胞質后的命運也至關重要。遺憾的是，目前似乎尚未建立關于ADC最佳內化速率等參數的通用范式，ADC的安全性和有效性仍需通過個案實證來確定。

基于這些ADC理想靶標特征，我們該如何篩選優質ADC靶點呢？如前所述，靶點識別策略可分為適應癥依賴型和適應癥獨立型兩類。

2.2 適應癥依賴型ADC靶點選擇

適應癥依賴型ADC靶點篩選策略如同使用導航軟件——已知治療目標（目的地），但需探索具體實現路徑（行進路線）。根據研究團隊的專業優勢和對未滿足臨床需求的評估，某些癌癥類型可能獲得優先關注。這種策略始終以明確目標為導向，關鍵在于盡早制定并實施臨床開發計劃。

目前有50余種ADC處于臨床研發階段（表2.2，截止2016年數據），除少數特例外，靶點選擇呈現高度多樣性。其中多數靶向實體瘤抗原，也有相當數量針對血液系統惡性腫瘤。值得注意的是，FDA最早批準的兩個ADC藥物——曲妥珠單抗-美坦新偶聯藥（T-DM1）和靶向CD30的brentuximab vedotin（商品名Adcetris?），最初均作為"裸抗體"（未偶聯藥物）開發，且都始于特定適應癥的研究。

以HER2為例：其過表達是特定乳腺癌亞型的標志特征，鑒于其在腫瘤發生中的作用，早期就成為這些癌癥靶向治療的研究焦點。如前述，T-DM1由抗HER2抗體曲妥珠單抗與DM1彈頭偶聯而成。由于曲妥珠單抗的研發積累了豐富的HER2靶點數據和抗體特性資料，將其改造為ADC以提升療效成為合理選擇。

表2.2 臨床開發中的ADC（截至2016年7月數據）

同樣地，brentuximab vedotin（維布妥昔單抗）也源自裸抗體研發項目。通過聚焦在血液系統惡性腫瘤中高表達、而在正常組織中極少表達的抗原研究，CD30被確認為優質靶點。該靶點在霍奇金淋巴瘤、間變性大細胞淋巴瘤(ALCL)、皮膚T細胞淋巴瘤等血液惡性腫瘤中過表達，而在正常組織中僅見于活化的T/B細胞——靜息態T/B細胞完全不表達。研究人員篩選出具有抗腫瘤潛力的抗CD30抗體cAC10，該抗體在霍奇金淋巴瘤和ALCL的臨床前研究中表現優異并進入臨床開發階段。但將auristatin類彈頭MMAE與cAC10偶聯后，其療效顯著超越未偶聯的cAC10抗體，使得該ADC的臨床開發成為更優選擇。

CD30之所以被視為極具潛力的ADC靶點，關鍵在于其顯著的腫瘤/正常組織表達差異。這種差異基因表達分析正是適應癥導向型靶點篩選中最常用的策略之一。研究人員可采用多種方法進行此類分析，包括：

1）計算機模擬分析（in silico approaches）

2）腫瘤與正常細胞系的體外實驗（in vitro analyses）

3）患者腫瘤/正常組織活檢樣本的體內/離體研究（in vivo/ex vivo analyses）

目前可公開獲取的基因組數據庫包括：癌癥基因組圖譜（TCGA）、國際乳腺癌分子分型聯盟（METABRIC）和癌細胞系百科全書（CCLE）。這些數據庫匯集了來自數千例患者樣本的信息，涵蓋廣泛的癌癥適應癥，并提供差異基因表達、拷貝數變異、基因突變、甲基化狀態、外顯子測序、SNP基因分型以及與人類癌癥相關的miRNA等數據。通過對這些數據庫進行計算機模擬分析，有助于識別在特定癌癥類型（如METABRIC專攻乳腺癌數據）中差異表達的膜相關蛋白基因，這些基因可能成為抗體偶聯藥物（ADC）的理想靶點。

針對特定適應癥的潛在靶點，還可通過對比同一組織或器官中正常細胞與惡性細胞的基因表達譜來識別。這類研究能揭示特定癌癥類型中上調表達的基因，但需后續通過蛋白質檢測驗證靶點的差異表達水平。除依賴基因表達數據外，采用蛋白質組學方法直接鑒定癌癥特異性高表達蛋白是另一種有效策略。

定量蛋白質組學通常采用質譜技術分析正常/惡性組織細胞或活檢樣本中的蛋白水平。目前學界正在開發定量免疫組化（IHC）技術，用于原位測定候選靶點的相對蛋白表達量。以三陰性乳腺癌為例，這類蛋白質組學方法能鑒定出癌細胞特異性膜蛋白——這些蛋白在對應正常組織中要么完全缺失，要么表達量顯著偏低。

在鑒定出腫瘤差異表達的抗原后，關鍵要評估其是否適合作為ADC靶點：該抗原是否定位于細胞表面？抗體結合后能否有效內化？內化后是高效轉運至溶酶體還是發生再循環？表達量是否足以遞送足量細胞毒素？流式細胞術和共聚焦顯微鏡可分別用于檢測細胞表面定位和溶酶體共定位。 ADC引發細胞毒性所需的靶點表達水平需通過實驗確定，這既取決于靶點本身特性（如抗原表位分布），也與抗體的結合表位選擇及親和力等參數密切相關。

在確定特定適應癥的潛在靶點后，必須深入分析這些靶點在目標適應癥中的臨床表達特征。ADC開發過程中的關鍵決策（如靶點選擇及藥物設計）均需基于兩大參數：靶點在選定適應癥中的表達密度與表達普遍性。

簡而言之，腫瘤靶點表達模式可分為五類：1）高表達且均一分布；2）高表達但異質性分布；3）低表達且均一分布；4）低表達伴異質性分布；5）完全不表達（圖2.2）。為準確評估靶點在目標適應癥中的表達密度與普遍性，需通過免疫組化（IHC）技術對腫瘤組織芯片或大量臨床腫瘤樣本進行系統檢測——這種全面的蛋白表達分析將為ADC開發策略提供決定性依據。

圖2.2 腫瘤中靶基因的表達模式。通常，靶基因的相對表達水平是根據該靶基因在被檢測組織中的表達強度（無、低或高）和表達密度（無異質性、異質性或均質性）來確定的。因此，靶基因的表達水平可以從無表達到高表達/均質表達不等。

單純的高靶點表達雖更為理想，但并不能完全預測ADC的療效，因為靶點在腫瘤組織中的分布密度同樣會影響藥物效果。例如：針對高表達且均勻分布的靶點，采用較低藥物抗體比（DAR）或低效價彈頭的ADC可能已足夠有效。這種均勻表達模式還能避免在ADC設計中引入"旁觀者殺傷效應"（即游離彈頭從凋亡細胞釋放后對鄰近靶陰性細胞的毒性）。若靶點在正常組織中表達較低，采用無旁觀者殺傷效應的彈頭偶聯ADC，既能降低脫靶毒性，又可減少對正常組織的靶向殺傷。

對于靶點表達量低但分布均勻的腫瘤，可能需要采用高效價彈頭偶聯的ADC進行治療，但這可能增加毒性風險。不過，這種低表達但均勻分布的特性也意味著無需依賴具有旁觀者殺傷效應的彈頭，反而可能限制整體毒性。相反，當靶點呈異質性表達時（尤其是計劃作為單藥使用時），旁觀者殺傷效應可能至關重要——這類ADC既能選擇性清除腫瘤中的靶陽性區域，又能對靶陰性區域造成足夠損傷。但根據靶點表達水平的不同，可能需要采用高效價彈頭偶聯ADC，這同樣會增大毒性風險。

采用適應癥導向的ADC靶點篩選策略時，盡早確定靶點的臨床表達模式對優化ADC設計具有決定性意義。

靶點表達譜分析對判斷是否需要開發伴隨診斷（用于患者篩選）至關重要。若某適應癥患者群體絕大多數呈現靶點高表達且均勻分布，則可能無需基于靶點表達篩選患者，自然也不必開發伴隨診斷。然而，對于靶點表達普遍性和密度存在顯著差異的適應癥，則需通過伴隨診斷篩選出靶點表達量達到治療閾值的患者。

考慮到目前已上市ADC藥物的毒性問題，采用伴隨診斷排除潛在無效患者（這些患者不僅難以獲益，還可能承受藥物不良反應）具有臨床價值——部分學者認為這甚至涉及倫理考量。值得注意的是，判斷"足夠表達水平"的標準會因靶點特性、適應癥類型及ADC藥物組成而異。例如：HER2過表達的閾值約為每個細胞100萬個分子，而處于臨床評估階段的CD70靶向ADC，其有效閾值低至每個細胞3.4萬個分子，且表達水平與藥物敏感性無明顯相關性。

與大多數ADC研究一樣，抗原表達水平與藥物活性（療效/安全性）的關聯性必須通過實證研究確定。

彈頭的早期選擇是指適應癥導向型ADC靶點策略的另一關鍵要素。目前臨床評估的ADC彈頭主要分為兩大類：微管蛋白抑制劑（MTIs）和DNA靶向劑。

1）微管蛋白抑制劑

通過穩定或破壞微管蛋白聚合誘導細胞凋亡，包括：

- 奧瑞他汀類（auristatins）

- 美登素類（maytansinoids）

- 微管溶素類（tubulysins）

2）DNA靶向劑

通過烷基化/交聯DNA發揮作用，涵蓋：

- 卡奇霉素（calicheamicin）

- 吡咯并苯二氮?二聚體（PBD dimers）

- 杜卡霉素類（duocarmycins）

而伊立替康活性代謝物SN-38則屬于拓撲異構酶抑制劑

需特別說明的是，這些ADC彈頭的作用機制雖與常規化療藥物類似，但其效力通常顯著更強。

在選擇ADC靶點時，必須綜合考慮不同癌種對特定彈頭類別的敏感性差異及彈頭相關毒性。臨床開發的核心目標之一就是評估哪類小分子對特定癌癥適應癥最有效，現有標準治療方案正是基于這一原則確立。

以結直腸癌為例，獲批藥物（如卡培他濱、奧沙利鉑、氟尿嘧啶和伊立替康）主要通過阻斷DNA復制誘導細胞凋亡發揮作用。雖然仍有改進空間，但這些藥物已展現出最佳療效；而微管蛋白抑制劑（如長春花生物堿和紫杉烷類）對該癌種則無效。相反，乳腺癌化療方案主要采用微管蛋白抑制劑（多西他賽、紫杉醇、長春堿等）。

需注意的是，雖然ADC遞送的細胞毒素與全身給藥可能存在敏感性差異，但選擇ADC彈頭時仍應遵循以下原則：

a.優先選擇：在該適應癥中已證實最有效的細胞毒素類別；

b.避免使用：既往證明無效的藥物類別；

c.毒性考量：彈頭本身的脫靶毒性特征。

臨床數據顯示，ADC的毒性譜往往與游離彈頭相似，提示多為脫靶效應。各類彈頭均有其特征性毒性（與偶聯抗體無關），例如：

- 常見毒性：中性粒細胞減少癥、血小板減少癥（多數彈頭）

- 奧瑞他汀/美登素類：胃腸道毒性、周圍神經病變

- 卡奇霉素：皮膚毒性、淋巴細胞減少癥

基于這些特性，可針對性設計ADC方案：

- 對于靶點在胃腸道腫瘤或正常胃腸組織表達的適應癥，應慎用MMAE（甲基奧瑞他汀E）類ADC，以免加劇其固有的胃腸道毒性

- 鑒于ADC彈頭的高效力，必須盡一切可能預防毒性發生

聚焦特定癌癥適應癥也有助于降低抗體偶聯藥物（ADC）的相關毒性。例如，由于血液系統靶點通常比實體瘤靶點更具組織特異性，靶向血液惡性腫瘤的ADC可能比靶向實體瘤抗原的ADC具有更好的耐受性。如前所述，僅有極少數靶點能被歸類為腫瘤特異性靶點——以上皮性癌表達的抗原為例，因其源于上皮組織的特性，這些抗原在正常組織中同樣表達的概率更高。血液系統靶點雖也可能在正常細胞中表達，但這類抗原通常僅存在于循環細胞群中，在實體組織中的表達極為有限。此外，血液細胞群通常比實體組織具有更強的再生能力，因此即使出現顯著耗竭，這些細胞的再生能力也能在停止治療后克服暫時性損傷。當然，這一結論的前提是靶點不同時表達在造血干細胞上，否則ADC的靶向作用可能導致關鍵血細胞群的永久性耗竭。

相較于實體瘤，血液惡性腫瘤可能更易于采用ADC治療，這得益于多重因素。目前學界認為，實體瘤治療面臨的主要障礙之一是：注入循環系統的ADC藥物實際抵達或滲透至腫瘤部位的有效劑量過低。而血液惡性腫瘤則不存在這些障礙——其靶細胞群本就存在于ADC直接作用的循環系統中。此外，血液系統惡性腫瘤的靶點通常在患者群體中呈現同質性表達。鑒于這些潛在優勢，目前已獲批或進入后期臨床試驗的ADC藥物中近半數靶向血液惡性腫瘤也就不足為奇。不過，早期臨床試驗中的ADC仍以實體瘤靶向為主，這表明盡管攻克實體瘤需要跨越更高門檻，但學界對新一代ADC仍充滿信心，特別是曲妥珠單抗-美坦新偶聯物在轉移性乳腺癌治療中的獲批及顯著療效更強化了這一趨勢。

提升ADC對實體瘤和血液惡性腫瘤療效的潛在策略之一，是聚焦各類癌癥相關的癌癥干細胞（CSC）。根據假說，CSC是導致腫瘤治療抵抗、后續復發及侵襲性增強的關鍵因素。利用ADC靶向攻擊腫瘤中的CSC群體，有望獲得更持久的臨床響應。合適的靶點可能同時表達于CSC和普通腫瘤細胞，也可能為CSC特異性靶點。對于后者，可能需要具備"旁觀者殺傷效應"的ADC，或聯合普通腫瘤細胞療法，以實現快速且持久的治療響應。彈頭選擇對CSC靶向治療同樣關鍵：鑒于CSC處于靜息狀態或增殖速率較低，ADC需搭載能誘導這類低增殖細胞發生細胞毒性的彈頭。

前文重點探討了針對特定疾病類型的靶點篩選與ADC設計策略。然而，采用適應癥無關的靶點發現方法同樣具有可行性。

2.3 與適應癥無關的ADC靶點選擇

若將適應癥依賴型的ADC靶點選擇比作導航軟件——已知目的地卻不知路線，那么適應癥無關型（獨立型）的ADC靶點選擇則如同向旅行顧問描述理想度假體驗，由其引導你前往未知的、卻符合期待的秘境。后者通過篩選具有理想特性的靶點，再基于"該ADC在何處可能最有效"的假設來選定適應癥。實現這種廣譜靶點篩選的方法之一，便是表型篩選技術。

表型篩選是一種通過篩選能引發特定表型或細胞響應的分子來識別新靶點及活性分子的強效方法。傳統應用場景包括：在特定疾病來源的細胞群中篩選化合物庫，評估其誘導細胞毒性或調控特定信號通路的能力。該方法無需預先了解分子靶點或化合物作用機制，而是通過初篩命中結果逆向解析其作用機理。

雖然此類篩選通常針對小分子庫開展（事實上已用于ADC彈頭發現），但同樣適用于生物制劑篩選，并能以盲篩方式發現新型ADC靶點。例如：可利用單鏈抗體片段（scFV）庫、噬菌體展示庫、雜交瘤細胞甚至完整抗體庫進行此類表型篩選。

篩選過程可采用廣譜腫瘤細胞系平臺（如NCI60細胞系組）實現適應癥無關性操作——不同于常規篩選關注化合物細胞毒性或致癌信號通路抑制能力，該方法可針對ADC所需特性（如細胞表面結合與內吞功能）直接篩選生物分子。

盡管細胞表面定位是ADC靶點的重要屬性，但并非所有細胞表面抗原在與抗體結合后都會發生內化或轉運至溶酶體。因此，內化篩選對于ADC候選靶點的鑒定至關重要。目前已有多種內化檢測方法可供采用，這些方法通常利用“pH敏感熒光染料”——其僅在核內體/溶酶體等低pH環境中激活發光特性。該技術可用于篩選雜交瘤細胞或其他抗體庫，從而識別那些既能結合腫瘤細胞又能被內化的分子，這些分子往往具備成為優質ADC靶點的潛力。

當確認生物分子具有結合內化能力后，需進一步執行以下步驟：

1）靶點鑒定

2）臨床驗證（確認靶點在相關腫瘤樣本中的表達）

3）差異化篩選（通過正常細胞平行對照實驗，篩選腫瘤細胞特異性結合內化的抗體與靶點）

最終可針對表達該靶點的癌癥類型推進ADC開發。

盡管涉及內化及溶酶體轉運檢測的表型篩選屬于新興方法，但選擇具有這些特性的ADC靶點已有先例。以CD74（MHC II類相關恒定鏈）為例：該靶點在絕大多數B細胞惡性腫瘤中表達，已知其作為抗原呈遞過程的一部分會發生內化并轉運至晚期核內體區室，這使其成為ADC治療的理想候選靶點。基于此特性篩選出的抗體可介導極快速內化，由此開發的米拉珠單抗-阿霉素（milatuzumab-Dox）針對復發性多發性骨髓瘤、復發非霍奇金淋巴瘤（NHL）和慢性淋巴細胞白血病（CLL）開展臨床研究。

另一個典型案例是CD79b——作為B細胞受體的信號組分，該抗原僅在B細胞及大多數NHL適應癥中表達，且能在抗體結合后快速高效地內化并轉運至溶酶體。這些特性使其成為極富前景的ADC靶點，由此開發的泊洛妥珠單抗維多汀（polatuzumab vedotin，一種與MMAE偶聯的抗CD79b ADC）目前正針對彌漫大B細胞淋巴瘤和濾泡性NHL進行臨床試驗。這些成功案例為利用表型篩選鑒定新型ADC抗體及靶點提供了有力佐證。

如前述，通過分析腫瘤與正常細胞間差異基因/蛋白表達來篩選靶點，是適應癥依賴型研發的常規策略。類似的基因組學與蛋白質組學方法同樣適用于適應癥無關型靶點發現。例如：通過生物信息學分析發現淋巴細胞抗原6復合體E位點（LY6E）可作為ADC靶點。基于TCGA和METABRIC數據庫對35種人類腫瘤的基因組數據分析顯示，LY6E在卵巢癌、乳腺癌、結腸癌、胰腺癌、腎癌和胃癌等多種腫瘤中相較正常組織顯著過表達，目前已有以其為靶點的ADC進入臨床前研究。

牛津基因組解剖計劃（OGAP）作為專有蛋白質組數據庫，收錄了5000余種在惡性腫瘤中上調表達的跨膜蛋白。通過該數據庫或Swiss-Prot、UniProt等公共數據庫進行生物信息學分析（聚焦細胞表面蛋白），是另一種適應癥無關性靶點發現策略。但需注意的是，正如前文強調，這些膜蛋白是否具備高效內化及溶酶體轉運能力仍需實驗驗證。

2.4 結論與展望

近年來，ADC藥物領域取得了重大進展。然而，優質靶點的篩選與最佳藥物的構建仍主要依賴經驗性測試，而非理性設計流程。目前雖已總結出若干提升ADC功能的指導原則——例如需要采用高穩定性的偶聯化學和連接子以防止彈頭非特異性釋放，以及通過定點偶聯技術提升產品均一性和穩定性——但該領域仍存在顯著優化空間。

在以下方面已獲得更深入認知：

1. 特定疾病適應癥中最有效的ADC類型；

2. 不同靶點表達譜下的最佳治療方案；

3. 彈頭毒性差異：如微管抑制劑（MTI）類彈頭對同樣表達靶標的靜止期或低增殖正常細胞毒性顯著低于DNA損傷類彈頭。

隨著當前眾多ADC臨床試驗的推進，將會積累更多經驗教訓。但鑒于ADC結構的復雜性和參數組合的多樣性，開發安全有效的ADC藥物仍將持續依賴系統化的實驗評估。這種"設計-構建-測試-學習"的迭代循環，目前仍是推動ADC技術突破的核心范式。

盡管目前ADC臨床試驗中觀察到的毒性多為脫靶毒性，但靶向毒性仍是需要通過謹慎選擇靶點來解決的關鍵挑戰。真正具有腫瘤特異性的ADC靶點數量極為有限，且我們對正常細胞中靶點表達何時會引發不可接受毒性的認知仍不完善。臨床前體外模型對ADC療效（尤其是安全性）的預測價值有限，因此早期體內研究在ADC開發中至關重要。

在模型選擇與結果解讀時需特別注意：

a. 模型局限性

- 部分癌細胞系異種移植模型不能準確模擬真實人類癌癥

- 應考慮使用更具代表性的模型（如患者來源異種移植模型、免疫健全的同源模型）

b. 安全性研究挑戰

- 包括非人靈長類在內的安全模型，其靶點表達水平或模式可能與人類存在差異

- 研究結果需結合靶點表達的種屬差異進行審慎解讀

新型ADC策略有望拓展靶點選擇范圍，其中雙特異性/多特異性ADC最具前景：

- 雙表位ADC（結合同一靶點的兩個不同位點）：可顯著增強親和力或促進內化

- 作用機制假說：多表位抗體可誘導抗體-受體復合物交聯形成，從而將細胞內運輸途徑從循環轉向溶酶體降解

- 雙靶點ADC（"二合一"藥物）： 可同時殺傷不同癌細胞亞群

- 最具突破性的應用：靶向腫瘤細胞共表達（而正常細胞不表達）的兩種蛋白，通過更高親和力實現腫瘤特異性結合

因此，腫瘤靶點組合的鑒定將成為未來重要研究方向。

提升ADC藥物療效與安全性的另一途徑在于聯合其他療法。目前臨床前與臨床研究已開始探索具有疊加或協同效應的ADC組合方案。例如，最新研究表明某些ADC彈頭可誘導免疫原性細胞死亡，因此與PD-1/PD-L1檢查點抑制劑等免疫調節抗癌藥物聯用將產生增效作用。攜帶DNA損傷劑的ADC若與PARP靶向藥等DNA修復抑制劑聯用可能效果顯著，或在DNA修復機制突變的腫瘤中引發合成致死效應。因此，針對這類聯合療法篩選ADC靶點，既能提升療效又可降低用藥劑量從而減少毒性反應。

如何選擇具有臨床價值的優質ADC靶點仍是核心挑戰——除腫瘤特異性靶點稀缺外，靶標表達異質性、內化效率低、抗原脫落及癌種分布局限等問題更增加了開發難度。新型ADC靶點發現策略（如表型篩選和腫瘤膜組學技術）與雙特異性抗體等創新ADC技術的融合，將為這類抗癌療法的研發開辟新前沿。

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