腦聲小店基于深度科研洞察，專(zhuān)注為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提供"簡(jiǎn)器械·精實(shí)驗(yàn)"解決方案。我們突破高精設(shè)備局限，開(kāi)發(fā)手工定制化儀器及配件，通過(guò)科研巧思將基礎(chǔ)工具轉(zhuǎn)化為創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)方案。產(chǎn)品涵蓋行為學(xué)裝置、操作輔助工具等，使實(shí)驗(yàn)室在保持操作簡(jiǎn)效的同時(shí)，實(shí)現(xiàn)精細(xì)化數(shù)據(jù)采集，助力科研人員以創(chuàng)造性思維發(fā)掘簡(jiǎn)易儀器的潛在科研價(jià)值。

2025年6月17日，美國(guó)Arialys Therapeutics的Mitsuyuki Matsumoto在Nautre communications發(fā)表：Monoclonal humanized monovalent antibody blocking therapy for anti-NMDA receptor encephalitis，揭示了針對(duì)抗NMDA受體腦炎的單克隆人源化單價(jià)阻斷抗體治療。

抗NMDA受體（NMDAR）腦炎是一種嚴(yán)重的疾病，具有劇烈的精神和神經(jīng)癥狀，一種自身免疫性腦炎，由針對(duì)NMDA受體的異常抗體引發(fā)，常見(jiàn)于年輕女性，有時(shí)與卵巢畸胎瘤相關(guān)。被認(rèn)為是由致病性自身抗體結(jié)合到NMDAR的GluN1亞基的N端結(jié)構(gòu)域（GluN1-NTD）上，導(dǎo)致相鄰NMDAR交聯(lián)并被內(nèi)化所引起。本文介紹了ART5803，一種人源化的單價(jià)抗體作為抗NMDAR腦炎的潛在治療藥物。ART5803以高親和力結(jié)合GluN1-NTD不影響NMDAR的活性，也不會(huì)誘導(dǎo)其內(nèi)化。ART5803能夠阻斷患者來(lái)源的致病性自身抗體所引發(fā)的NMDAR內(nèi)化，并恢復(fù)NMDAR的功能。研究人員建立了一種狨猴動(dòng)物模型，通過(guò)持續(xù)腦室內(nèi)給予人類(lèi)致病性自身抗體誘發(fā)行為和運(yùn)動(dòng)異常。ART5803通過(guò)腦室輸注或外周注射可迅速逆轉(zhuǎn)這些異常。這些研究結(jié)果，結(jié)合ART5803在食蟹猴中的藥代動(dòng)力學(xué)特征，表明靜脈注射ART5803具有良好的治療潛力，有望成為治療抗NMDAR腦炎的一種快速起效且有效的新型療法。

圖一 ART5803的生成及其對(duì)GluN1-NTD的結(jié)合特性分析

已有研究報(bào)道，從抗NMDAR腦炎患者的腦脊液中克隆出單克隆抗體，這些抗體被認(rèn)為與疾病的發(fā)生機(jī)制密切相關(guān)。因此，作者通過(guò)重組技術(shù)合成了具有代表性的致病性自身抗體。抗NMDAR腦炎的主要發(fā)病機(jī)制是致病性抗NMDAR自身抗體通過(guò)二價(jià)結(jié)合交聯(lián)NMDAR從而誘導(dǎo)其內(nèi)化。這些研究強(qiáng)調(diào)，NMDAR信號(hào)減少是由于受體內(nèi)化，而不是這些自身抗體對(duì)受體的直接拮抗作用。此外，自身抗體的Fab片段（單價(jià)形式）不會(huì)引起受體內(nèi)化，也不會(huì)顯著影響NMDAR介導(dǎo)的電生理功能。致病性自身抗體的抗原識(shí)別位點(diǎn)已被證實(shí)局限于GluN1亞基的N端結(jié)構(gòu)域（GluN1-NTD）。因此提出一種能夠結(jié)合GluN1-NTD、阻止致病性自身抗體結(jié)合和NMDAR交聯(lián)，同時(shí)不影響NMDAR功能的單價(jià)抗體，可能在治療抗NMDAR腦炎方面具有應(yīng)用潛力。考慮到治療性抗體的分子結(jié)構(gòu)特性，決定專(zhuān)注于單價(jià)IgG形式。雖然Fab片段也可以作為單價(jià)治療形式，但其在體內(nèi)的清除速度遠(yuǎn)快于含有Fc結(jié)構(gòu)的IgG。此外，相比Fab，較大的單價(jià)IgG（約100 kDa）可能會(huì)對(duì)致病性自身抗體產(chǎn)生更強(qiáng)的空間位阻效應(yīng)。最終篩選出4種對(duì)GluN1-NTD結(jié)合能力強(qiáng)、并能有效抑制致病性-102 Ab結(jié)合的候選抗體。最終，選定ART5803作為人源化的IgG1型單價(jià)抗體，其對(duì)GluN1-NTD具有最高親和力。通過(guò)表面等離子共振分析測(cè)定了ART5803和致病性#003-102 Ab對(duì)人源GluN1-NTD的結(jié)合親和力。結(jié)果顯示，ART5803的親和力顯著高于#003-102 Ab。通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性ELISA檢測(cè)ART5803對(duì)#003-102 Ab結(jié)合的阻斷能力，發(fā)現(xiàn)ART5803可有效競(jìng)爭(zhēng)生物素標(biāo)記的#003-102 Ab與GluN1-NTD的結(jié)合，顯著優(yōu)于#003-102 Ab自身的阻斷能力。還解析了致病性#003-102 Ab Fab’片段與GluN1-NTD蛋白復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)，分辨率達(dá)到3.5 ?。GluN1-NTD由兩個(gè)子結(jié)構(gòu)域R1和R2組成。在NMDAR四聚體結(jié)構(gòu)中，這一結(jié)合位點(diǎn)位于受體側(cè)面，使得致病性自身抗體可通過(guò)雙臂結(jié)合相鄰受體，引發(fā)交聯(lián)。隨后，作者采用氫氘交換質(zhì)譜（HDX-MS）比較了#003-102 Ab-GluN1-NTD和ART5803-GluN1-NTD復(fù)合物中潛在的NMDAR結(jié)合表位。X射線(xiàn)共晶結(jié)構(gòu)中確定的所有明確的#003-102 Ab結(jié)合位點(diǎn)均包含在HDX-MS鑒定的潛在表位中。結(jié)果表明，#003-102 Ab和ART5803幾乎結(jié)合在GluN1-NTD上的相同表位，主要位于R2子結(jié)構(gòu)域，在R1子結(jié)構(gòu)域也有部分覆蓋。

圖二 ART5803逆轉(zhuǎn)了由致病性自身抗體在小鼠海馬神經(jīng)元中引起的NMDAR內(nèi)化和樹(shù)突棘萎縮

NMDAR的GluN1亞基是脊椎動(dòng)物進(jìn)化中最保守的蛋白之一，其中GluN1-NTD在人類(lèi)與食蟹猴之間的序列同源性為100%，與狨猴為99.7%，與大鼠和小鼠分別為98.5%和98.2%。ART5803和#003-102 Ab對(duì)來(lái)自人類(lèi)、食蟹猴、狨猴、大鼠和小鼠的GluN1-NTD蛋白均表現(xiàn)出相似的結(jié)合活性。為了研究致病性自身抗體及ART5803對(duì)NMDAR內(nèi)化和樹(shù)突棘形態(tài)的影響，作者對(duì)培養(yǎng)的海馬腦片進(jìn)行了活體成像觀(guān)察NMDAR表面表達(dá)水平和樹(shù)突棘大小。在體外培養(yǎng)6至8天的小鼠海馬腦片中，對(duì)CA1錐體神經(jīng)元共轉(zhuǎn)染TdTomato、SEP-GluN2A以及未標(biāo)記的GluN1，并在7天后進(jìn)行成像分析。在給予#003-102 Ab處理后，作者觀(guān)察到樹(shù)突棘中的NMDAR表面表達(dá)水平在3小時(shí)下降至72%，14小時(shí)下降至59%，同時(shí)樹(shù)突棘大小也在14小時(shí)顯著縮小。相比之下，給予同型對(duì)照抗體的樣本并未出現(xiàn)類(lèi)似變化，說(shuō)明這些效應(yīng)是#003-102 Ab特異性的。重要的是，單獨(dú)使用ART5803并不影響NMDAR的表面表達(dá)或樹(shù)突棘大小，表明其無(wú)明顯副作用或脫靶效應(yīng)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，將ART5803與#003-102 Ab同時(shí)給予，可有效阻止NMDAR表面表達(dá)和樹(shù)突棘大小的下降，說(shuō)明ART5803能夠阻斷#003-102 Ab引發(fā)的NMDAR內(nèi)化。最后評(píng)估了ART5803是否能在#003-102 Ab誘導(dǎo)的NMDAR減少之后實(shí)現(xiàn)功能恢復(fù)。實(shí)驗(yàn)中，作者首先用#003-102 Ab處理腦片3小時(shí)，此時(shí)NMDAR表面表達(dá)和樹(shù)突棘大小均已顯著下降。隨后加入ART5803，在14小時(shí)時(shí)觀(guān)察到NMDAR表達(dá)和樹(shù)突棘大小均顯著恢復(fù)至接近基線(xiàn)水平。這表明ART5803不僅具有預(yù)防作用，還具有治療潛力，能夠在病理改變發(fā)生后實(shí)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)。

圖三 腦室內(nèi)給予ART5803可逆轉(zhuǎn)致病性自身抗體在狨猴疾病模型中誘導(dǎo)的異常行為

為了評(píng)估ART5803在體內(nèi)的治療效果，作者建立了一種使用狨猴（非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物）的抗NMDAR腦炎動(dòng)物模型。已有研究顯示，B細(xì)胞可以浸潤(rùn)并駐留在抗NMDAR腦炎患者的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中并在腦脊液中產(chǎn)生可檢測(cè)水平的致病性抗NMDAR自身抗體。為了模擬大腦內(nèi)B細(xì)胞持續(xù)產(chǎn)生自身抗體的情況，通過(guò)導(dǎo)管對(duì)狨猴進(jìn)行持續(xù)腦室輸注致病性#003-102 Ab至第三腦室。在初步的劑量探索實(shí)驗(yàn)中確定了#003-102 Ab的ICV輸注劑量為每小時(shí)10 μg，該劑量可在腦脊液中達(dá)到約10–20 μg/mL的濃度，足以誘發(fā)并維持明顯的異常行為。使用改良版的異常評(píng)分量表（ARS），參考此前用于狨猴帕金森病模型的行為評(píng)估方法，對(duì)動(dòng)物的異常行為和運(yùn)動(dòng)障礙進(jìn)行量化評(píng)估，以反映抗NMDAR腦炎患者的行為和運(yùn)動(dòng)功能障礙。首先在相同的給藥途徑（腦室輸注）和劑量（每小時(shí)10 μg）下測(cè)試了ART5803在該狨猴模型中的療效，以驗(yàn)證其在體外和離體實(shí)驗(yàn)中觀(guān)察到的阻斷作用是否能在體內(nèi)體現(xiàn)。在初步研究中，確認(rèn)連續(xù)兩周通過(guò)ICV輸注ART5803耐受良好，不會(huì)引起狨猴明顯的異常行為。作者將導(dǎo)管植入狨猴大腦的第三腦室，并通過(guò)微量輸注泵持續(xù)輸注每小時(shí)10 μg的#003-102 Ab。在持續(xù)輸注兩周后（第14天），狨猴表現(xiàn)出顯著的行為異常，ARS評(píng)分從基線(xiàn)時(shí)的1.8顯著升高至9.6，表明模型成功誘導(dǎo)了類(lèi)似抗NMDAR腦炎的癥狀。從第14天開(kāi)始，在繼續(xù)輸注#003-102 Ab的同時(shí)，分別給予ART5803或?qū)φ湛贵w進(jìn)行持續(xù)ICV輸注，為期兩周。聯(lián)合使用ART5803兩周后，異常行為明顯減少，ARS評(píng)分從第14天的9.6下降至第28天的3.6，顯示出顯著的治療效果。而對(duì)照抗體治療組的ARS評(píng)分無(wú)明顯變化，說(shuō)明其無(wú)效。綜上所述，ART5803在體內(nèi)模型中有效逆轉(zhuǎn)了由致病性自身抗體引起的異常行為，進(jìn)一步表明其作為抗NMDAR腦炎治療藥物的潛力。

圖四 腹腔注射ART5803可逆轉(zhuǎn)致病性自身抗體在狨猴疾病模型中引起的GluN1減少

已有研究表明，致病性自身抗體可在大鼠大腦以及抗NMDAR腦炎患者大腦中顯著降低GluN1/NMDAR的表達(dá)水平。為了評(píng)估在腹腔給藥隊(duì)列中狨猴大腦內(nèi)GluN1的表達(dá)情況，在最后一次ARS評(píng)分（第21天）后，將狨猴左腦用于免疫染色分析，右腦的大腦皮層整體用于western blot分析。作者使用經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的抗體對(duì)GluN1和GluR2（AMPA受體）進(jìn)行了免疫染色和蛋白檢測(cè)。初步研究中的狨猴大腦免疫染色結(jié)果（獨(dú)立評(píng)估#003-102 Ab腦室輸注與ART5803腹腔注射效果）顯示了兩種處理方式在大腦中分布模式的不同。單獨(dú)進(jìn)行腦室輸注#003-102 Ab（每小時(shí)10 μg，持續(xù)4周）時(shí)，抗體主要集中在腦室附近的區(qū)域；而通過(guò)腹腔注射給予ART5803（每次400 mg/kg，每周兩次，連續(xù)兩周）后，ART5803幾乎均勻分布在整個(gè)腦實(shí)質(zhì)中，幾乎所有灰質(zhì)中的神經(jīng)元突起都被ART5803結(jié)合。在患者中，NMDAR表達(dá)最顯著的下降出現(xiàn)在大腦皮層。此外，由于靠近腦室，前腦區(qū)域檢測(cè)到更高密度的#003-102 Ab信號(hào)。因此，采用QuPath軟件腳本對(duì)前額葉皮層的免疫染色結(jié)果進(jìn)行了DAB顯色信號(hào)強(qiáng)度的定量分析，結(jié)果顯示，在接受#003-102 Ab腦室輸注并輔以對(duì)照溶劑腹腔注射的組別中，GluN1染色信號(hào)顯著低于接受ART5803腹腔注射的組別。ART5803治療組的GluN1表達(dá)水平更接近未接受治療的對(duì)照組。還通過(guò)蛋白印跡分析檢測(cè)了來(lái)自全腦皮層總蛋白中GluN1、GluR2、PSD95（突觸標(biāo)志物）和GAPDH的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，在全腦皮層中，接受對(duì)照溶劑腹腔注射的組別GluN1表達(dá)水平顯著低于ART5803治療組。而GluR2、PSD95和GAPDH的表達(dá)水平在兩組間無(wú)明顯差異。綜上所述，ART5803通過(guò)腹腔注射能夠有效逆轉(zhuǎn)由致病性自身抗體引起的GluN1表達(dá)下降，顯示出其在體內(nèi)恢復(fù)NMDAR功能的潛力。

綜上所述，基于其獨(dú)特的作用機(jī)制ART5803有望與免疫抑制療法聯(lián)合使用。ART5803可能作為緩解急性癥狀的有效且快速起效的治療手段，隨后或可同時(shí)配合如類(lèi)固醇或利妥昔單抗等免疫抑制治療，以維持長(zhǎng)期療效。此外，ART5803也可能成為由持續(xù)產(chǎn)生抗NMDAR自身抗體所引起的復(fù)發(fā)性或難治性疾病的獨(dú)特治療選擇。ART5803在狨猴模型中表現(xiàn)出的顯著且快速的療效， ART5803有望成為抗NMDAR腦炎患者的一種有前景的治療方案，并可能適用于其他由抗NMDAR自身抗體引發(fā)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。

文章來(lái)源

https://doi.org/10.1038/s41467-025-60628-1